טכניקה ליצירת חלקיקים דמויי נגיף שפעת באמצעות מערכת יונקים

חלקיקים דמויי וירוס, או VLPs, מחקים את מבנה הנגיף אך חסרים חומר גנטי נגיפי, מה שהופך אותם ללא אלימים. ל-VLPs יש אפיטופים אנטיגניים הקשורים למשטח המזוהים על ידי תאי החיסון, מה שהופך אותם למועמדים אידיאליים לחיסון.

כדי ליצור VLPs רקומביננטיים של שפעת, קח וקטורי ביטוי אוקריוטיים.

שני וקטורים מכילים גנים המקודדים להמגלוטינין, או HA, ונוראמינידאז, או NA - חלבונים מבניים של נגיף השפעת. הווקטור השלישי מכיל את גן ה-gag, המקודד חלבוני ליבה של נגיף הכשל החיסוני האנושי.

הוסף ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים קטיוני. קבוצת ראשי השומנים הטעונים חיובית מקיימת אינטראקציה עם DNA טעון שלילי, ויוצרת שכבה דו-שכבתית סביב הווקטורים - ויוצרת קומפלקסים של טרנספקציה של ליפוזום.

הוסיפו קומפלקסים לתאי מארח של יונקים מתורבתים המתאימים לייצור VLP, ודגרו. קומפלקסים של טרנספקציה נכנסים לתאים דרך אנדוציטוזיס - קרום הליפוזום מתמזג עם קרום האנדוזום כדי לשחרר את הווקטורים לתוך הציטופלזמה.

וקטורים נכנסים לגרעין, מה שמוביל לביטוי הגנים הנגיפיים. עם סינתזת HA ו-NA ברטיקולום האנדופלזמי, החלבונים עוברים לקרום הפלזמה דרך מסלול ההפרשה.

חלבוני הליבה מסונתזים בציטופלזמה ומועברים לאתר ההרכבה כדי לעגן בקרום הפלזמה. רכיבים נגיפיים שהצטברו עוברים הרכבה עצמית ל-VLPs וניצנים מהתא המארח.

קצור את ה-VLPs ששוחררו לעיבוד במורד הזרם.

ביום הטרנספקציה, הכינו תמיסות ליפוזום ו-DNA לפי המלצות היצרן. העבר את תאי ה-DNA עם הרכב DNA של 1:1:2 של HA:NA:Gag וכמות DNA כוללת של 40 מיקרוגרם לבקבוק T-150. חזור על שלב זה כדי ליצור תשע צלוחיות T-150 בנפח כולל של 200 מיליליטר.

לאחר מכן, יש לדלל את תמיסות ה-DNA והליפוזום באמצעי טרנספקציה נטולי סרום ללא אנטיביוטיקה כך שכל בקבוק יכיל נפח כולל של 24 מיליליטר. החזר את הצלוחיות לחממה ושמור על התאים במדיום תרבית טרנספקציה עד ליום הקציר של חלקיק דמוי נגיף או VLP.

העבירו את הסופרנטנט לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר כדי לקצור את התרבית מהתאים לאחר 72 עד 96 שעות לאחר הטרנספקציה. סובב את התאים כלפי מטה כדי לגלול את הפסולת התאית. אספו את הסופרנטנטים וסננו אותם דרך קרום נקבוביות של 0.22 מיקרון.