יצירת חלקיקים דמויי וירוס Chikungunya באמצעות מערכת ביטוי Baculovirus בתאי חרקים

חלקיקים דמויי נגיף צ'יקונגוניה, VLPs, הם מבנים לא זיהומיים המורכבים מחלבוני מעטפת ויראלית המוטבעים בתוך שכבת שומנים דו-שכבתית, ונטולי חומר גנטי.

כדי לייצר Chikungunya VLPs, הדביקו תאי חרקים Spodoptera frugiperda Sf9 בנגיפי בקולונציה רקומביננטיים המבטאים קלטת גנים מבנית של צ'יקונגוניה. הקסטה מורכבת ממקדם נגיף הבקולו המאוחה עם גנים מבניים של צ'יקונגוניה המקודדים קפסיד, וחלבוני מעטפת.

במהלך הדגירה, גליקופרוטאינים של מעטפת נגיף הבקולו-וירוס נקשרים לקולטני פני השטח על תאי החרקים. זה מקל על כניסה ושחרור של DNA ויראלי לתוך הציטופלזמה, ויוצר פוליפרוטאינים המכילים קפסיד צ'יקונגוניה וחלבוני מעטפת.

לאחר סינתזה, מחשוף אוטוקטליטי של חלבון הקפסיד מייצר את הפוליפרוטאין המבשר בעל חלבוני מעטפת ברטיקולום האנדופלזמי, ER. בלומן ER, אנזימים מבקעים את הפוליפרוטאין המבשר, ויוצרים חלבונים בודדים הנכנסים לתא גולגי להמשך עיבוד, ויוצרים הטרוטרימרים של חלבונים.

פרוטאזות תושבות גולגי מבקעות את ההטרוטרימרים של החלבונים, ומייצרות חלבוני מעטפת בוגרים עם חלבוני E2 ו-E1. חלבוני מעטפת אלה עוברים לממברנה, נובטים ל-VLPs ומשתחררים לתווך.

העבירו את התרבית הנגועה לצינור ולצנטריפוגה כדי לגלול את תאי החרקים. שאפו את הסופרנטנט המכיל VLP וסננו אותו כדי להסיר פסולת.

התסנין המתקבל, המכיל VLPs של צ'יקונגוניה, מוכן למחקרים אימונופתולוגיה.

תרבית הכינה בעבר Spodoptera frugiperda, או תאי Sf9, בתרחיף בצלוחיות ספינר על ידי ערבוב מתמיד ב-130 סל"ד על מערכת צלחת ערבוב מרובת נקודות. שמור על נפחי תרבות בלא יותר ממחצית נפח בקבוק הספינר לאוורור תקין. לאחר מכן, בטא CHIK VLPs על ידי הדבקת 250 מיליליטר של תאי Sf9 בבקבוק ספינר בצפיפות של 2 x 10⁶ תאים למיליליטר עם נגיף בקולו-וירוס רקומביננטי שהוכן בעבר, והחזיר את התאים לאינקובטור של 28 מעלות צלזיוס.

השתמש באי-הכללה של טריפן כחול כדי לקבוע אם כדאיות התא ירדה ל-70% עד 80%. לאחר האישור, העבירו את התרביות ישירות מהתרחיף לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר, וסובבו את התאים כלפי מטה. אספו את הסופרנטנטים, וסננו אותם דרך קרום נקבוביות של 0.22 מיקרון לפני המשקע.