טכניקה לביסוס מודל זיהום חיידקי בזחלי חרקים

הניחו זחל של Galleria mellonella - עש השעווה הגדול יותר - על משטח הזרקה, וחשפו את הצד הגחוני.

קחו למשל מיקרו-מזרק המכיל תרחיף של Mycobacterium bovis BCG lux - זן חיסון חיידקי חי שעבר שינוי גנטי כדי לייצר ביולומינסנציה. הזרקו את התרחיף בפרולג האחרון, או בתוספות הבטן - שחרור חיידקים לתוך המולימפה - נוזל מחזור הדם בחלל הגוף.

מעבירים את הזחל לסביבה מבוקרת ודוגרים. החיידקים מנצלים את המולימפה כמקור עשיר לחומרים מזינים ומתרבים.

המוציטים - תאי חיסון חסרי חוליות בהמולימפה - מתקבצים סביב החיידקים ויוצרים מבנה דמוי גרנולומה כדי למנוע התפשטות זיהום. ההמוציטים משחררים פרו-פנולוקסידאז, שעובר מחשוף פרוטאוליטי ליצירת פנולוקסידאז.

פנולוקסידאז מסנתז מלנין אשר מבודד את החיידקים באתר הזיהום. שקיעת פיגמנט המלנין גורמת למלניזציה מערכתית, הכהה את צבע הזחל.

ההמוציטים בולעים את החיידקים לפגוזומים. הפאגוזומים מתמזגים עם ליזוזומים כדי לרכוש אנזימים ליטיים, וגורמים לפירוק חיידקים. תת-קבוצה של חיידקים יכולה להתחמק מפירוק פגוליזוזומלי ולשכון בהמוציטים - מה שמוביל לזיהום מתמשך.

מדוד את הביו-לומינסנציה של החיידקים במרווחי זמן מוגדרים. ירידה ראשונית בביולומינסנציה מעידה על תגובה אנטי-בקטריאלית יעילה, בעוד שהתייצבות הערך מעידה על זיהום מתמשך.

שמור על זחלי הכוכב שנרכשו בחושך ב-18 מעלות צלזיוס עם ההגעה והשתמש תוך שבוע מרגע הרכישה. זהה ובחר זחלים בריאים לניסויים על סמך צבע קרם אחיד, גודל ומשקל מתאימים, תנועתיות גבוהה ויכולת לתקן את עצמם כאשר הם מתהפכים. בעזרת פינצטה קהה, ספרו בזהירות את הזחלים הבריאים לצלחת פטרי מרופדת בשכבת נייר פילטר, ושמרו בטמפרטורת החדר בחושך עד לשימוש.

הכן את פלטפורמת ההזרקה על ידי הדבקת נייר סינון עגול בקוטר 94 מילימטר על משטח שטוח ומורם. שאפו שלושה נפחים של 70% אתנול לתוך מזרק מיקרו של 25 מיקרוליטר כדי לעקר, להשליך ולשטוף עוד יותר עם שלושה נפחים של PBST סטרילי. לאחר מכן, השעו מחדש את חיסון ה-BCG lux המוכן ושאבו 10 מיקרוליטר לתוך המיקרו-מזרק המעוקר. השתמש במזרק נפרד כדי לשאוב PBST לשליטה שלילית.

לאחר 10 זריקות, יש להשעות מחדש את חיסון BCG lux כדי להבטיח תרחיף תאים אחיד. השתמש בפינצטה כדי להרים זחל אחד ולהניח על משטח ההזרקה. על הרציף, הפוך את הזחל על גבו ושיתק על ידי אבטחת הראש והזנב בעזרת הפינצטה. אתר את הפרולג השמאלי האחרון שסופר לאחור מראש הזחל והכנס בזהירות את קצה המחט בעומק של 5 עד 6 מ"מ בזווית של 10 עד 20 מעלות למישור האופקי. הזרקו את החיסון מהמזרק.

לאחר כל הדבקה, העבירו את הזחל הנגוע לצלחת פטרי מרופדת בשכבת נייר פילטר. צלחת פטרי אחת בגודל 94 מילימטר יכולה להכיל עד 30 זחלים. אחסן את צלחת הפטרי בקופסה כהה מאווררת בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

עקוב אחר הישרדות הזחלים כל 24 שעות. זחלים נחשבים מתים כאשר הם לא מצליחים לזוז בתגובה למגע. רשום את ההישרדות והעריך מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן מנטל-קוקס.