אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:23 דק׳ • July 8th, 2025
כדי למדוד את עומס החיידקים in vivo, התחל עם זחלי חרקים מעוקרים שנדבקו מראש ב-Bacillus Calmette-Guérin, או BCG lux. BCG lux הוא זן Mycobacterium bovis BCG מהונדס גנטית המבטא לוציפראז - אנזים המייצר ביולומינסנציה.
העבירו זחל חרקים לצינור מטריצת ליזינג המכיל חיץ עם כדורי פלדה. בעזרת הומוגנייזר, הומוגניזציה של הזחל, ושחרר את הרכיבים התוך-תאיים, כולל חיידקים, לתוך המאגר.
צנטריפוגה את הצינור כדי לאסוף את ההומוגנאט ולהעביר אותו לצינור לומינומטר.
שטפו את צינור המטריצה עם מאגר המכיל חומר ניקוי כדי להמיס שברי תאים ולשחרר שאריות חיידקים.
שלב את השברים באותו צינור לומינומטר והוסף את מצע הלוציפראז. מצעים נכנסים לחיידקים ומקיימים אינטראקציה עם אנזימי לוציפראז, וכתוצאה מכך ביולומינסנציה. טען את הצינור לתוך לומינומטר ומדוד את הביו-לומינסנציה.
הלומינומטר מודד את עוצמת האור הנפלט ומחשב את יחידת האור היחסית, או RLU - המעידה על העומס in vivo של BCG בזחל חרקים.
מורחים את התרחיף ההומוגני המדולל על צלחת אגר המכילה פיפרצילין ודוגרים כדי לגדל BCG באופן סלקטיבי כמושבות נפרדות. המושבות על הלוח מייצגות את היחידה היוצרת מושבה, או CFU. יחס RLU ל-CFU מתאם ביולומינסנציה עם כדאיות חיידקים.
כל 24 שעות, בחרו באופן אקראי חמישה זחלים נגועים, והשתמשו במקלון צמר גפן ספוג באתנול 70% כדי לעקר בעדינות את משטחי הזחל. הנח את הזחלים בנפרד לתוך צינורות מטריצת ליזינג של שני מיליליטר המכילים 800 מיקרוליטר PBS סטרילי. לאחר מכן, השתמש בהומוגנייזר כדי להומוגניזציה של הזחלים למשך 60 שניות במהירות של שישה מטרים לשנייה.
צנטריפוגה את צינורות הליזינג ב-3,500 פעמים גרם למשך חמש שניות כדי להסיר את ההומוגנאט מהמכסים, ולשפוך בזהירות את ההומוגנאט לחמישה צינורות לומינומטר סטריליים בנפרד. שמור 100 מיקרוליטר הומוגנט בצינור תגובה סטרילי של 1.5 מיליליטר. שחזר את כל ההומוגנאט שנותר על ידי שטיפת צינורות מטריצת הליזינג עם מיליליטר אחד של PBST, ופיפטה לתוך צינורות הלומינומטר המתאימים.
מערבל את צינורות הלומינומטר, ומדוד את הביו-לומינסנציה של ההומוגנטים על גבי לומינומטר. לאחר מכן, הכינו דילולים סדרתיים פי 10 של 100 מיקרוליטר הומוגנאט השמורים בצלחות תרבית של 24 בארות באמצעות PBST. פיפטה 10 מיקרוליטר מהדילול על כל צלחת אגר מידלברוק 7H11, והשתמש במפזר צלחת סטרילי למריחה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבועיים.
לאחר מכן, ספור יחידות יוצרות מושבות.