מערכת מדווח וירוסים רקומביננטי במבחנה לזיהוי זיהום ויראלי

קחו תרבית תאים של סרטן הכבד האנושי, מהונדסת גנטית כדי לבטא נתרן טאורוכולט פוליפפטיד או NTCP - קולטן טרנסממברני

.

הוסף נגיף הפטיטיס B רקומביננטי, או HBV. הנגיף מורכב ממעטפת חיצונית המכילה חלבונים על פני השטח ונוקלאוקפסיד פנימי התוחם את הגנום. החדרת גן מדווח לוציפראז מעכבת את יכולת הרבייה של הנגיף.

חלבון מעטפת ויראלית נקשר לקולטן NTCP של התא המארח.

NTCP מקיים אינטראקציה עם קולטן גורם הגדילה האפידרמלי, EGFR, ואוליגומריס, וגורם לאנדוציטוזיס בתיווך EGFR של הנגיף.

המעטפת הנגיפית מתמזגת עם קרום האנדוזום כדי לשחרר את הנוקלאוקפסיד, שמתפרק בקומפלקס הנקבוביות הגרעיניות.

הגנום הנגיפי נכנס לגרעין והופך ל-DNA מעגלי סגור קוולנטי או cccDNA - תבנית יציבה - המקודדת חלבונים נגיפיים, כולל לוציפראז.

במרווחי זמן מוגדרים מראש, קצרו את התאים וליזה כדי לשחרר לוציפראז תוך תאי.

הציגו מצע מדווח. לוציפראז מחמצן את המצע ומייצר אות.

עלייה בפעילות הלוציפראז לאחר ההדבקה מעידה על ביטוי מתמשך של הגנום הנגיפי.

תאי HepG2 צלחת, המבטאים ביציבות נתרן טאורוכולאט, הובלה משותפת של פוליפפטיד או NTCP הרגישים לזיהום HBV, ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

יום אחד לפני ההדבקה, צלח כ-5 x 10⁴ תאי HepG2/NTCP לבארות של צלחת מצופה קולגן של 96 בארות ב-0.1 מיליליטר של מדיום תרבית. הפשירו HPV רקומביננטי באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, עד שיישאר מעט קרח בבקבוקון.

הכן את המדיום לזיהום על ידי שילוב של 78 מיקרוליטר של מדיום תרבית טרי, שני מיקרוליטר של DMSO, 10 מיקרוליטר של 40% PEG8000 ב-1X PBS ו-10 מיקרוליטר של HPV רקומביננטי. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת HBV רקומביננטית לכל באר של צלחת של 96 בארות.

יום אחד לאחר ההדבקה, השתמש ב-300 מיקרוליטר של PBS כדי לשטוף את התא שלוש פעמים, כדי להסיר את חלבון המדווח המזהם מחלק הנגיף. הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית המכיל 2% DMSO לתאים הנגועים, ודגר במשך שבוע או פחות.

כדי לבצע ניתוח של זיהום HBV, שבוע לאחר ההדבקה, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים הנגועים שלוש פעמים. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר ליזה לתאים הנגועים. נדנד את צלחת התרבות למשך חמש דקות, ואז צנטריפוגה ב -2000 פעמים גרם למשך חמש דקות. הוסף 50 מיקרוליטר ממצע המדווח לצלחת לומינומטר, ולאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של ליזט התא לצלחת, וערבב על ידי ניעור קצר. לבסוף, הנח את הצלחת בלומינומטר והתחל לקרוא.