בדיקה חיידקית בסרום לפעילות חיידקית בתיווך משלים של נוגדנים

קח דגימת סרום מדוללת סדרתית המכילה נוגדנים חד שבטיים נגד ליפופוליסכרידים, או LPS - מרכיב ממברנה חיצונית של חיידקים גרם שליליים.

הכניסו חיידקים גרם שליליים. נוגדנים בסרום נקשרים ל-LPS חיידקים.

הוסף חלבונים משלימים. קומפלקס C1 נקשר לנוגדנים הקשורים ל-LPS, ויוצר C1 פעיל אנזימטית.

C1 מופעל מבקע את C4 ו-C2 ליצירת C3 convertase, אשר מבקע את C3 ליצירת C5 convertase. ההמרה מבקעת את C5 כדי לייצר C5b, המגייס C6 ו-C7. הקומפלקס שנוצר נכנס לתוך הממברנה החיצונית ומתחבר ל-C8 ול-C9 מרובה, ויוצר נקבובית.

נזק לקרום החיצוני מערער את יציבות הממברנה הפנימית, וגורם לליזה של תאים.

מניחים את התערובת על צלחת אגר ומורחים. דגירה לגידול חיידקים. כסו את הצלחת באגר המכיל טריפניל טטרזוליום כלוריד, או TTC, אשר מצטמצם על ידי דהידרוגנאזות מיקרוביאליות, ומעניק צבע אדום למושבות חיידקים.

מספר המושבה עולה עם דילול הדגימה, מה שמעיד על פעילות חיידקית מופחתת עם ריכוז נוגדנים נמוך יותר.

כדי להתחיל, דגרו את הדגימות באמבט מים חמים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשבית את דגימות הבדיקה. השג לוחית בדיקה ו-20 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לעמודות 1 עד 12 של שורות A עד G. הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לעמודות 1 ו-2 של שורה H. טען 30 מיקרוליטר מכל דגימת בדיקה בשכפול לשורה H של לוחית הבדיקה.

כדי להתחיל לבצע דילול סדרתי פי שלושה של דגימות הבדיקה, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להסיר 10 מיקרוליטר מבארות 3H עד 12H. העבירו את הדגימות לבארות המתאימות בשורה G, ופיפטה למעלה ולמטה 8 עד 10 פעמים כדי לערבב היטב את הדגימה. לאחר מכן, הוציאו 10 מיקרוליטר מהבארות הללו, העבירו לבארות המתאימות בשורה F, ופיפטה למעלה ולמטה 8 עד 10 פעמים לערבוב. המשך בתהליך דילול סדרתי זה דרך שורה A. לאחר ערבוב הבארות בשורה A, הסר והשליך 10 מיקרוליטר מבארות 3A עד 12A כך שהנפח הסופי בכל הבארות יהיה 20 מיקרוליטר.

שלפו בקבוקון אחד של מלאי חיידקי מטרה קפואים, והפשירו אותו בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לדלל את החיידקים ב-20 מ"ל של מאגר בדיקה בהתאם לגורם הדילול האופטימלי שנקבע מראש. בעזרת פיפטה רב ערוצית, הוסף 10 מיקרוליטר של חיידקים מדוללים לכל באר של לוחית הבדיקה.

אחזר בקבוקון אחד של משלים ארנב קפוא ובקבוקון אחד של BRC קפוא מושבת בחום. השתמש במים זורמים קרים כדי להפשיר את הבקבוקונים לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מערבבים 100 מיקרוליטר חום ו-BRC מושבת חום עם 400 מיקרוליטר של מאגר בדיקה. הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת BRC זו של 20% מושבתת חום לכל הבארות בעמודה 1. מערבבים 1 מיליליטר של BRC מקורי עם 4 מיליליטר של מאגר בדיקה. הוסף 50 מיקרוליטר מתערובת 20% זו לכל הבארות בעמודות 2 עד 12. הניחו את הצלחת על שייקר צלחת למשך 10 עד 15 שניות כדי לערבב בעדינות את צלחת הבדיקה.

דגרו את לוחית הבדיקה בחממה מיקרוביולוגית למשך שעתיים. בינתיים, הסר את המכסים משתי צלחות אגר LB, והניח את הצלחות עם הפנים כלפי מעלה בארון בטיחות ביולוגי למשך 40 עד 60 דקות לייבוש. בסיום הדגירה, העבירו את לוחית הבדיקה לקרח רטוב, ודגרו למשך 10 עד 20 דקות כדי לעצור את התגובה. בעזרת פיפטה בת 12 ערוצים, מערבבים את הבארות בשורה H וצלחת ספוט 10 מיקרוליטר מתערובת התגובה על תחתית צלחת LBA. הטה מיד את הצלחת ואפשר לכתמים לרוץ כ -1.5 עד 2 סנטימטרים.

חזור על הליך זה עבור שורות G, F ו- E, ואתר אותן מעל השורה הקודמת. דגרו את לוחות ה-LBA בטמפרטורת החדר עד שהתמיסה תיספג בלוחות ה-LBA. לאחר מכן, הניחו את המכסים על הצלחות, והעבירו אותם הפוכים לחממה מיקרוביולוגית לדגירת לילה.

למחרת, הוסף 25 מ"ל של אגר כיסוי ב-55 מעלות צלזיוס המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר TTC ו-0.1% נתרן אזיד לכל צלחת LBA. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לאפשר לחיידקים השורדים לפתח צבע אדום. לאחר מכן, השתמש במצלמה דיגיטלית כדי לצלם את הצלחות. העבירו את התמונות למחשב, והשתמשו בתוכנת ספירת המושבה המשולבת של NIST כדי לנתח את התמונות כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.