ניתוח של efferocytosis של thymocytes אפופטוטי על ידי מקרופאגים פריטוניאליים

אפרוציטוזיס הוא התהליך שבו תאים פגוציטים מנקים תאים אפופטוטיים.

כדי לנתח אפרוציטוזיס, השג תימוציטים עכברים רגישים לאפופטוזיס. דגירה עם צבע CFSE חדיר לתאים.

אסטרזות תוך-תאיות מבקעות את CFSE לצבע פלואורסצנטי אטום לתאים, ומכתימות תימוציטים. יש להוסיף סרום מנוטרל בחום כדי למנוע כתמים עודפים.

צלחת את התימוציטים המוכתמים על צלחת תרבות. הוסף סטאורוספורין, מעכב חלבון קינאז, המשבש את מפל האיתות התאי הקריטי, וגורם לאפופטוזיס. יתר על כן, שאריות פוספטידילסרין עוברות לעלון החיצוני של קרום התא, ומתפקדות כ"אותות אכול אותי".

הוסף ריכוזי תימוציטים אפופטוטיים הולכים וגדלים לבארות צלחות מרובות בארות המכילות מקרופאגים צפקיים של עכברים פעילים, המבטאים קולטן ספציפי טירוזין קינאזות.

קינאזות אלו קושרות את הפוספטידילסרין החשוף על תימוציטים אפופטוטיים, מה שמקל על הפנמתם על ידי מקרופאגים.

לאחר הדגירה, הסר תימוציטים אפופטוטיים צפים חופשיים. הוסף נוגדנים נגד CD11b מתויגים פלואורופור, הנקשרים למולקולות CD11b של מקרופאגים.

בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, התבונן בתימוציטים אפופטוטיים פלואורסצנטיים בתוך מקרופאגים פלואורסצנטיים שונים, המעידים על אפרוציטוזיס.

בארות עם ריכוזי תימוציטים אפופטוטיים גבוהים יותר מציגות תימוציטים מופנמים מוגברים.

כדי לקצור תימוציטים לאחר פתיחת חלל החזה של עכבר C57/Black-6 נאיבי, השתמש במלקחיים מעוקלים בעלי קצה דק כדי לשלוף את בלוטת התימוס. מניחים את האיבר בכלי תרבית רקמות המכיל 10 מיליליטר מדיום RPMI-1640. טוחנים את כל התימוס כנגד הקצוות החלביים של 2 שקופיות מיקרוסקופ, ומסננים את תרחיף הרקמה המתקבל דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מיליליטר. אוספים את התימוציטים על ידי צנטריפוגה, ומשעים מחדש את הגלולה ב -40 מיליליטר.

לאחר הספירה, צנטריפוגה שוב את התאים, והשעו מחדש עד 2 x 10⁸ תאים ב -20 מיליליטר PBS טרי לכל צינור של 50 מיליליטר. סמן את התאים עם CFSE של 5 מיקרו-מולרי ב-20 מיליליטר PBS לכל צינור. הפוך את הצינורות פעמיים עד שלוש לערבוב, לפני הדגירה של התימוציטים לא יותר משתי דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. בתום הדגירה, עצרו את התגובה עם 10 מיליליטר של סרום סוסים מושבת בחום, ואספו את התאים על ידי צנטריפוגה.

השעו מחדש את התאים המסומנים ב -40 מיליליטר PBS טרי לספירה וצנטריפוגה, ואחריו שטיפה נוספת עם 40 מיליליטר מדיום. לאחר השטיפה הבינונית, השעו מחדש את התימוציטים בריכוז בינוני של 7 x 10⁶ תאים למיליליטר של תרבית רקמה, וזרעו את התאים בצלחת תרבית רקמה של 100 מילימטר. לאחר מכן, הוסף סטאורוספורין לתרבית התאים בריכוז סופי של 1 מיקרומולרי, והנח את הצלחת באינקובטור תרבית רקמה למשך 4 שעות.

לבידוד מקרופאגים צפקיים, יש להזריק לשני עכברי C57/Black-6 תוך צפקית עם 1 מיליליטר של 3% תיוגליקולט מיושן ביום 0, לפני פתיחת עור הבטן מבלי להפריע לצפק ביום החמישי.

כדי לשטוף את חלל הצפק, השתמש במזרק של 10 מיליליטר המצויד במחט בגודל 18 כדי לדחוף במהירות 10 מיליליטר של מאגר כביסה לתוך החלל לפני שאיבה איטית של מאגר הכביסה לאיסוף לתוך צינור של 50 מיליליטר. שטפו את הצפק פעמיים עם PBS. השעו מחדש את המקרופאגים הצפק ב-2 פעמים 10 עד שישית תאים למיליליטר של ריכוז בינוני של תרבית רקמה.

לאחר מכן, זרעו 500 מיקרוליטר מקרופאגים לכל באר של צלחת בת 24 בארות, והניחו את הצלחת בחממת תרבית רקמות למשך שעתיים. בתום הדגירה, שאפו את הסופרנטנט כדי להסיר את התאים הצפים, והוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית רקמות לכל באר.

הוסף מיד 0 עד 12 x 10⁶ תימוציטים ב -500 מיקרוליטר מדיום לכל באר של התרבות, והניח את הצלחת בחממת תרבית הרקמות למשך 4 שעות. בתום הדגירה יש לשטוף כל באר פעמיים עם PBS טרי כדי להסיר תאים אפופטוטיים צפים חופשיים, ולאחר מכן שטיפה אחת עם מאגר מכתים. לאחר מכן, סמנו את המקרופאגים הקשורים לצלחת עם 200 מיקרוליטר של מאגר צביעה בתוספת נוגדן מתאים נגד CD11b לכל באר, והניחו את הצלחת על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.