בדיקה עבור ציטוטוקסיות חיידקית חוץ-תאית בתיווך חלבון על PMN
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:14 דק׳ • July 8th, 2025
קחו תרבית של Staphylococcus aureus, חיידק פתוגני המפריש לוקוסידין - רעלן יוצר נקבוביות - המורכב ממרכיבי S ו-F מונומריים.
גלול את התאים ולדלל באופן סדרתי את הסופרנטנט. העבירו את הסופרנטנט המכיל לויקוצידין למיקרו-צלחת המכילה לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים, או PMNs, ודגרו.
רכיב ה-S נקשר לקולטנים טרנסממברניים ספציפיים ב-PMNs, ואחריו הטרו-אוליגומריזציה עם רכיב F כדי להכניס לקרום התא, וכתוצאה מכך להיווצרות נקבוביות.
הנקבובית גורמת לירידה ביוני אשלגן תוך-תאיים, ומפעילה את תחום הפירין ממשפחת NLR המכיל חלבון 3 או NLRP3.
NLRP3 נקשר לחלבון דמוי כתם הקשור לאפופטוזיס המכיל תחום גיוס קספאז, או ASC, המגייס פרו-קספאז-1, ויוצר דלקת.
פרוטאוליזה אוטומטית ממירה פרו-קספאז-1 לקספאז-1 פעיל, וגורמת למוות תאי.
קצור את התאים במרווחי זמן מוגדרים. הוסף פרופידיום יודיד או PI, שנכנס לתאים מתים דרך ממברנות פגומות כדי לקשור DNA, ופולט פלואורסצנטיות.
באמצעות ציטומטריית זרימה, כמת תאים מוכתמים ב-PI כדי להעריך את ההשפעה הציטוטוקסית של ריכוז הלוקוסידין וזמן הדגירה.
תרבית S. aureus למשך הלילה במדיה מתאימה, באמצעות אינקובטור רועד המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס יום לפני הניסוי. תת-תרבות S. aureus על ידי ביצוע דילול של 1 עד 100 של תרביות חיידקים לילה עם מדיה טרייה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול עד שהחיידקים מגיעים
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים