בדיקת ציטוטוקסיות של זני סטפילוקוקוס זהוב על נויטרופילים בעקבות פגוציטוזה

קח זני Staphylococcus aureus אלימים ופחות אלימים.

הוסף סרום כדי להקל על החיידקים.

העבר ריכוזי חיידקים הולכים וגדלים לבארות צלחות מרובות בארות מצוננות המכילות נויטרופילים. טמפרטורות נמוכות מונעות הפעלת נויטרופילים.

צנטריפוגה כדי להקל על פגוציטוזיס מסונכרנת.

קולטני נויטרופילים קושרים את האופסונינים, ומפעילים הפנמת חיידקים לפאגוזומים.

בחיידקים אלימים, הסביבה הפגוזומלית מעוררת ביטוי של רעלים ציטוליטיים.

רעלנים אלה יוצרים נקבוביות, משבשים את הפגוזומים ומסכנים את שלמות קרום הנויטרופילים.

עם זאת, החיידקים הפחות אלימים מציגים ביטוי רעלן ציטוליטי מופחת.

לאחר הדגירה, נתק את הנויטרופילים והעביר אותם לצינורות ציטומטר זרימה המכילים צבע פלואורסצנטי פרופידיום יודיד (PI).

הצבע נכנס לנויטרופילים עם ממברנות שנפגעו ומכתים את ה-DNA.

בעזרת ציטומטר זרימה, נתח את הנויטרופילים לצביעה PI.

עלייה תלוית ריכוז בשיעור הנויטרופילים החיוביים ל-PI בעקבות פגוציטוזיס של הזן האלים, בהשוואה לזן הפחות אלים, מצביעה על הציטוטוקסיות של הזן האלים כנגד נויטרופילים.

כאשר Staph aureus בתרבית הגיע לצמיחה מעריכית אמצעית, העבירו 1 מיליליטר של חיידקים מתורבתים לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה ב-5000 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את S. aureus על ידי שאיבת סופרנטנט מבלי להפריע לגלולה, והשעו מחדש את החיידקים הגלוליים ב-1 מיליליטר DPBS. מערבולת את הדגימות למשך 30 שניות. צנטריפוגה את הדגימות בחום של 5000 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.

כדי להגדיל את Staph aureus, ראשית, יש להשעות מחדש את הגלולה החיידקית ב-1 מיליליטר של 20% סרום אנושי. לאחר מכן, דגרו דגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה למשך 15 דקות. Wash opsonized Staph aureus לאחר צנטריפוגה, כפי שהוצג קודם לכן. דילול זני Staph aureus אופסוניים ל-1 x 10⁸ יחידות יוצרות מושבה, CFUs למיליליטר, עם RPMI קר כקרח. מערבלים את הדגימה למשך 30 שניות, ומניחים על קרח.

אשר את ריכוזי Staph aureus המשמשים לבדיקות אלה על ידי ציפוי 1 עד 10 דילולים סדרתיים של חיידקים על אגר. בעדינות, הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של כל זן Staph aureus, או RPMI, לבקרות חיוביות ושליליות ל-PMNs בצלחת של 96 בארות על קרח משלב 1.14. צלחת סלע בעדינות כדי להפיץ את Staph aureus בבארות.

סנכרן פגוציטוזיס על ידי צנטריפוגה ב-500 גרם למשך שמונה דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ודגיר צלחת ב-37 מעלות צלזיוס, מיד לאחר הצנטריפוגה כזמן 0. בנקודות הזמן הרצויות, הניחו את הצלחת על קרח, והוסיפו 200 מיקרוליטר DPBS קרים כקרח המכילים 1 מיקרוליטר של פרופידיום יודיד לכל צינור ציטומטריית זרימה, ולאחר מכן, העבירו דגימות לצינור המתאים להן.