מדוע כימות של amastigotes תוך-תאיים חשוב לצורך תיקוף המטרה?

כימות של amastigotes תוך-תאיים מספק מדד ישיר לערכיות (virulence) וליכולת השכפול של Leishmania בתוך מקרופאגים, מה שמאפשר להעריך האם תרכובת מסוימת משבשת את מחזור החיים התוך-תאי של הפתוגן. קריאה פנוטיפית זו תומכת בתיקוף המטרה (target validation) על ידי קישור עיכוב מולקולרי לתוצאות פונקציונליות במערכת הרלוונטית למחלה.

כיצד בידוד משתנה השכפול התוך-תאי תומך בתהליך הגילוי (discovery pipeline)?

על ידי התמקדות ביצירת amastigote בתוך ואקואולות פראזיטופוריות (parasitophorous vacuoles), הבדיקה מבודדת את שלב השכפול התוך-תאי כמשתנה מרכזי התלוי בארגנויות (virulence), ובכך היא מאפשרת לחוקרים להעריך תרכובות שחוסמות באופן ספציפי את הדיפרנציאציה או את ההישרדות בתוך תאי המאכסן. דבר זה מאפשר הפחתת סיכונים במטרות המעורבות בחילוף חומרים של ברזל, הבשלת פגוזום או מנגנוני הישרדות של הטפיל.

מה מאפשרות מדידות כמותיות של גרעיני מקרופאגים מזוהמים?

מדידה כמותית של גרעיני amastigote הצבועים ב-DAPI המצטברים סביב גרעיני המקרופאגים מאפשרת השוואה אובייקטיבית של שיעורי הזיהום בין תנאים ניסיוניים שונים, ובכך תומכת בניתוח תגובה למס (dose-response) ובאישור פגיעות (hit confirmation) במסעי סריקה. נתונים אלו מספקים קריאה מבוססת מיקרוסקופיה הניתנת להרחבה להערכת השפעות של תרכובות על עומס הפרזיטים התוך-תאיים.

מדוע דרישות השחזור חשובות לשיתוף פעולה בין-תפקודי?

דרישות שכפול מוגדרות — הכוללות דיפרנציאציה סטנדרטית של מקרופאגים, תזמון הדבקה ופרוטוקולי קיבוע — מבטיחות עקביות של הבדיקה בין מעבדות וצוותי פרויקט, ובכך מאפשרות שיתוף והשוואה מהימנים של נתונים. דבר זה תומך ברצף תרגומי על ידי מתן אפשרות לקבוצות גילוי, סריקה וקבוצות פרה-קליניות להפיק נתונים ברי השוואה להערכת virulenty.

אילו יכולות ניתוח סטטיסטי נדרשות לפני היישום?

היישום דורש יכולת לכמת ולהשוות תדרי תאים נגועים בין תנאים שונים באמצעות שיטות סטטיסטיות כגון t-tests או ANOVA כדי לקבוע הבדלים מובהקים בעומס האמסטיגוטים (amastigote load) בין קבוצות הטיפול לקבוצות הביקורת. דבר זה מאפשר בחירת פגיעות (hits) מבוססת נתונים וניתוח של קשרי מבנה-פעילות (SAR) במאמצים לאופטימיזציה של תרכובות מובילות.

הערכת אלימות הלישמניה בתוך מקרופאגים מתורבתים

JoVE Encyclopedia of Experiments

אימונולוגיה

0 צפיות • 4:46 דק' • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה מקרופאגים שמקורם במח עצם על כיסויים.

טפלו במקרופאגים עם Leishmania promastigotes - השלב הזיהומי של הטפיל.

במהלך הדגירה, הטפילים מקיימים אינטראקציה עם מקרופאגים, מה שמקל על הרכבת F-actin סביב אתר האינטראקציה.

מקרופאגים בולעים את הטפילים בפאגוזומים המוקפים ב-F-actin, ויוצרים ואקואולים טפיליים או PVs - נישה שכפולה.

בתוך PVs, טפילים משחררים גורמי הישרדות, מגבירים את הצטברות ה-F-actin סביב הוואקואולים ומעכבים את היזוגם עם ליזוזומים.

בנוסף, טפילים מווסתים את ייצור הפסידין - הורמון פפטיד מקרופאגים, מעכב שחרור ברזל ומעלה את רמות הברזל התוך תאי.

זרם הברזל לוואקואולים מקדם התמיינות פרומסטיגוטים לאמסטיגוטים פתוגניים ומקל על הכפלתם, ומגביר את האלימות.

לאחר הדגירה, יש לשטוף כדי להסיר טפילים חופשיים, ולאחר מכן, לתקן ולחלחל את המקרופאגים הנגועים.

הכנס צבע פלואורסצנטי של חומצת גרעין כדי לצבוע את הגרעינים של מקרופאגים ואמסטיגוטים נגועים.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, גרעינים קטנים מקובצים סביב הגרעין הגדול של המקרופאג מאשרים את נוכחותם של טפילים תוך-תאיים, ומדגימים את האלימות של הלישמניה.

ביום השביעי או השמיני לאחר התרבית, השתמש בקצה שאיפה המותאם לקו ואקום כדי להעביר ארבעה כיסויי זכוכית 12 מילימטר מעוקרים בחיטוי לתחתית כל באר של צלחת תרבית בת שש בארות ללא חפיפה. הכינו צלחות זהות לכל נקודת זמן של הניסוי. לאחר מכן, שטפו את תרביות המקרופאגים שמקורן במח העצם פעמיים עם PBS טרי של 37 מעלות צלזיוס וחמישה מיליליטר PBS ללא סידן ומגנזיום, בתוספת EDTA מילימולר אחד לכל צלחת.

לאחר חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, אסוף את התאים המנותקים בצינור חרוטי של 50 מיליליטר, ושטוף כל צלחת פעמיים עם חמישה מיליליטר נוספים של PBS ללא סידן ומגנזיום. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את המקרופאגים בחמישה עד 10 מ"ל של מדיום מקרופאגים טרי שמקורו במח עצם על קרח. לאחר הספירה, יש לדלל את התאים לריכוז של 5 x 10⁵ למיליליטר במדיום מקרופאגים טרי שמקורו במח עצם ולהוסיף שני מיליליטר תאים לבאר לצלחת 6 הבארות. לאחר מכן, דגרו את התאים למשך הלילה בחממת תרבית התאים.

כדי להדביק את התאים ב-L amazonensis, יש לדלל את תרחיף הטפיל לריבוי הניסוי המתאים של זיהום, ולהוסיף 50 עד 100 מיקרוליטר של טפילים לכל באר של כל צלחות שש הבארות, כולל כל נקודות הזמן של הניסוי. דגרו את המקרופאגים שמקורם במח העצם לתקופת ההדבקה והטמפרטורה המתאימים.

לאחר מכן, שטפו את הבארות שלוש פעמים עם שני מיליליטר PBS טרי של 37 מעלות צלזיוס ללא סידן או מגנזיום לבאר, וקבעו את דגימות נקודת הזמן הראשוניות עם 1.5 עד 2 מ"ל של 2% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות. עבור הצלחות המתאימות לנקודות הזמן המאוחרות יותר, הוסף 2 מיליליטר של מדיום מקרופאג טרי שמקורו במח עצם לכל באר, והחזיר את הצלחות לחממה המתאימה. לאחר מכן, תקן ושטוף את התאים עבור כל נקודת זמן שנותרה כפי שהודגם זה עתה, ואחסן את הדגימות ב-4 מעלות צלזיוס ב-PBS טרי.

כדי להכתים את התאים ב-DAPI, החלף את הסופרנטנט ב-1.5 מ"ל PBS טרי ללא סידן ומגנזיום, בתוספת חומר ניקוי לא יוני 0.1% למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש שטיפות של 2 מיליליטר עם PBS ללא סידן או מגנזיום. לאחר מכן, צבעו את התאים בשני מיקרוגרם למיליליטר DAPI במיליליטר PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש כביסות, הנח את הכיסויים עם צד התא כלפי מטה על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית בודדות המותקנות עם מגיב הרכבה נגד דהייה זמין מסחרית.

לאחר מכן, כדי לכמת את מספר התאים הנגועים, השתמש במטרת שמן הטבילה פי 100 של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ובמונה עמנואל כדי לזהות את מספר גרעיני האמסטיגוטים הקטנים יותר המקובצים סביב כל גרעין מקרופאג גדול מוכתם ב-DAPI.