בדיקת זיהום חיידקי לחקר אינטראקציות אנאירוביות בין חיידקים לתאים מארחים

התחל בתרבית של תאי אנדותל.

החלף את המדיה במדיה אנאירובית. דגירה בתא אנאירובי לאיזון טמפרטורה.

הוסיפו את Porphyromonas gingivalis, חיידק אנאירובי פתוגני, ודגרו לזמן קצר.

לחיידקים יש בליטות חלבון, הידועות בשם פימבריה, הנקשרות למולקולות הידבקות ספציפיות על תאי האנדותל, מה שמקל על היצמדות החיידקים.

קשירה זו מפעילה מפלי איתות תוך-תאיים, וכתוצאה מכך סידור מחדש של שלד הציטו של אקטין והפנמת חיידקים לפאגוזומים.

לאחר הדגירה, הסר מדיה. שטפו עם מאגר אנאירובי כדי להסיר חיידקים חוץ-תאיים שאינם נדבקים.

הוסף חומר ניקוי עדין כדי לחלחל את קרומי התאים המארחים ולגרום לליזה של תאים, לשחרר חיידקים מופנמים ומחוברים לפני השטח מבלי לגרום נזק.

מדללים את החיידקים המכילים ליזאט במדיה ומכינים דילולים סדרתיים.

צלחת את הדילולים הללו על צלחות אגר דם. דגירה בתנאים אנאירוביים כדי לאפשר ל-Porphyromonas gingivalis להתרבות וליצור מושבות.

לאחר הדגירה, ספור את היחידות היוצרות מושבה (CFUs) על כל צלחת כדי לכמת חיידקים המחוברים לפני השטח ומופנמים, מה שמעיד על אינטראקציות בין חיידקים לתאים מארחים.

לצורך תרבית וניסויים עם Porphyromonas gingivalis, נשמר תא אנאירובי ויניל עם אווירה מלאכותית המכילה 80% חנקן, 10% מימן ו -10% פחמן דו חמצני.

הנח 30 צלחות אגר דם, 500 מיליליטר PBS ומיליליטר של גורם גדילה אנדותל כלי דם, או מדיום VEGF, בתוך החדר האנאירובי 24 שעות מראש כדי לאזן את הריאגנטים.

זרע 4 פעמים 10 עד 5 תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים, או HUVECs, לבאר בצלחות של שש בארות במדיום VEGF והשאיר אותם בחממת תרבית התאים למשך הלילה לצורך הצמדה. הכינו תרביות Porphyromonas gingivalis בעירוי מוח-לב, או מדיום BHI, כמתואר בטקסט הנלווה, ואפשרו לתרביות להגיע לשלב היומן כאשר הצפיפות האופטית של התרבית ב-660 ננומטר נעה בין 0.5 ל-0.7.

העבירו את החיידקים לצינור של 15 מיליליטר ועטפו חתיכת פרפילם סביב הכובע כדי למנוע חשיפה אירובית. לאחר מכן, צנטריפוגה את החיידקים ב -5,000 פעמים גרם למשך 10 דקות. בתוך החדר האנאירובי, שטפו את החיידקים הגלולים עם PBS אנאירובי, וסובבו שוב ב-5,000 פעמים גרם למשך 10 דקות. השעו מחדש את החיידקים במדיום VEGF.

כדי להדביק את ה-HUVECs ב-Porphyromonas gingivalis, העבירו את צלחות שש הבארות מהחממה לתא האנאירובי. שאפו את המדיום מבארות הבדיקה, ושטפו שלוש פעמים עם PBS אנאירובי.

קבע את מספר התא מנציג אחד היטב על ידי בדיקת אי הכללה של טריפאן כחול. לאחר מכן, הוסיפו 2 מיליליטר לבאר של מדיום VEGF אנאירובי והניחו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה האנאירובית למשך 20 דקות לשיווי משקל.

קבע את הצפיפות האופטית של החיידקים והשהה אותם בנפח מספיק של מדיום VEGF כדי להדביק תאים בריבוי זיהום של 100 ל-1 חיידקים לתאים. מוסיפים את התרחיף החיידקי לתאים ודוגרים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לזיהום. לליזה של תאים, בתוך החדר האנאירובי, הכינו תמיסת ספונין במשקל של 1% לנפח במדיום BHI, וסננו דרך מסנן של 0.2 מיקרון.

כדי לחקור אינטראקציות חיידקיות עם תאים מארחים, הסר את צלחת שש הבארות מהאינקובטור ושאף את מדיום הזיהום. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS אנאירובי. לאחר מכן, הוסיפו 2 מיליליטר תמיסת ספונין לכל באר ודגרו למשך 15 דקות כדי לאפשר ליזה של תאים.

לאחר מכן, מגרדים את התאים מתחתית הבאר, ומדללים את התא ליזאט 1 עד 1 במדיום BHI. לאחר מכן, בצע דילולים סדרתיים החל מ-1 עד 100. צלחת 200 מיקרוליטר של דילול מתאים על צלחות אגר דם. עטפו את הצלחות בפרפילם, ודגרו אותן באינקובטור אנאירובי של 37 מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים כדי לאפשר היווצרות מושבה. לאחר מכן, בעזרת קופסת אור, ספרו את היחידות היוצרות מושבה, או CFUs על כל צלחת.