הערכת פעילות הרג אופסונופאגוציטית נגד פתוגנים חיידקיים

התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה תרחיף סטרפטוקוקוס פנאומוניה.

הכנס נוגדנים המכוונים לאנטיגן פני השטח של חיידקים, המקיימים אינטראקציה עם אנטיגנים חיידקיים על פני השטח. זה מצפה את החיידקים בנוגדנים, ויוצר חיידקים אופסוניים לזיהוי חיסוני.

זרעו את הבארות בנויטרופילים שמקורם בלימפוציטים בדם היקפי אנושי בתוספת סרום ארנב המכיל חלבונים משלימים.

במהלך הדגירה, חלבוני המשלים כגון C3b מופקדים על פני השטח של החיידקים, מה שמוביל לציפוי אופסונין נוסף על החיידקים שעברו אופסונונים - מה שמשפר את זיהוי החיידקים על ידי נויטרופילים.

קולטני פני השטח הספציפיים על הנויטרופילים מקיימים אינטראקציה עם האופסונינים על החיידקים, מה שמקל על בליעת חיידקים באמצעות פגוציטוזיס.

בתוך הפאגוזום, נויטרופילים מפרקים את החיידקים הנבלעים, ומפחיתים את ספירת החיידקים במאגר.

לאחר הדגירה, אתר את תמיסת התרבות המשותפת המדוללת על צלחת אגר דם כדי לאפשר לחיידקים בודדים ליצור מושבות.

השווה את מספר המושבות בחיידקים שטופלו באופסונין לחיידקים לא מטופלים.

פחות מושבות עם טיפול באופסונין מצביעות על הרג חיידקים גבוה יותר, מה שמרמז על הרג אופסונופגוציטי מוצלח.

הפשירו צינור אחד של מלאי חיידקים. חיידקי גלולה ב-6,000 פעמים גרם למשך שתי דקות, והשעיה מחדש של כדור התא ב-OBB בדילול האופטימלי שהושג בשלב הקודם. פיפטה 10 מיקרוליטר של דילול החיידקים המושעה לבאר בצלחת תרבית תאים תחתונה עגולה של 96 בארות. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של נוגדן מתאים או טיפול תרופתי לכל באר ניסוי בשכפול.

עבור בארות בקרה, השתמש ב-1X PBS או OBB, בהתאם למאגר המשמש לבארות הטיפול. לנער את צלחת הדגימה בכ-90 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך שעה.

כדי לקצור את התאים הממוינים ב-HL60 שטופלו ב-DMF שלושה ימים לפני כן, גלולה את התאים ב-500 פעמים גרם למשך שלוש דקות. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה עם לפחות 10 מיליליטר של 1XPBS. גלולה את התאים השטופים ב -500 פעמים גרם למשך שלוש דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-OBB.

הוסף סרום ארנב לתינוקות סטרילי לא מדולל בנפח אחד עד חמש אחרונים. לאחר תרבית חיידקים של שעה, חלקו כל דגימה לבארות כפולות לשתי קבוצות. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר מתערובת המשלים HL60 לכל קבוצה ניסיונית של בארות ו-50 מיקרוליטר של OBB לבארות החיידקים בלבד. מנערים את צלחת 96 הבארות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

כדי לצלחת את הדגימות, יש לדלל כל באר עם OBB בנפח סופי של אחד עד חמישה כך שלכל דגימה יהיה נפח של לפחות 50 מיקרוליטר. לאחר מכן, פיפטה 50 מיקרוליטר מכל דגימה ישירות על אזור ייעודי של צלחת תרבית חיידקים, תוך הבטחת מרווח הולם בין הדגימות. מכסים ומניחים לדגימות להתייבש כ-15 דקות בטמפרטורת החדר.

הופכים את הצלחות ותרבית למשך הלילה בחום של 30 מעלות צלזיוס. לחלופין, צלחות תרבית בצנצנות אנאירוביות, כדי לבדוק אם תנאים אנוקסיים משפיעים על צמיחת החיידקים או כדי לשלוט במורפולוגיה. לאחר תרבית לילה, ספרו את המושבות בכל אזור דגימה ייעודי והמשיכו לניתוח נתונים על ידי השוואת מספר התאים החיים בכל קבוצה לבקרות המתאימות.

ההיבטים הקשים ביותר של ביסוס טכניקה זו בפעם הראשונה יהיו ככל הנראה אופטימיזציה של CFUs ההתחלתיים של מלאי החיידקים, כמו גם הבטחת התמיינות יעילה של תאי HL60.