JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:18 דק' • July 8th, 2025
התחל עם תת-אוכלוסיות מקרופאגים M1 ו-M2 דבקות, הנבדלות על ידי סמני פני השטח הספציפיים שלהן. תאים אלה נגועים ב-Mycobacterium tuberculosis עם תווית פלואורסצנטית.
הוסף מאגר FACS לבארות התרבית.
EDTA במאגר מאפשר ניתוק תאים מבארות התרבית.
העבר את תרחיף התא לצינורות מיקרו-צנטריפוגה.
צנטריפוגה את הצינורות. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים בקוקטייל נוגדנים נגד מקרופאגים מצומד פלואורוכרום וצבע חיות, Zombie-UV.
הצבע הקרינה זומבי-UV נכנס לתאים מתים דרך ממברנות פגומות ונקשר לחלבונים ציטופלזמיים, ומאפשר התמיינות ברורה מתאים לא מוכתמים ברי קיימא.
יתר על כן, הנוגדנים נגד מקרופאגים מצומדים פלואורסצנטיים נקשרים לאנטיגנים מטרה על המקרופאגים, ומאפשרים זיהוי דיפרנציאלי של תת-אוכלוסיות.
שטפו את התאים כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. צנטריפוגה. הסר את ה-supernatant.
השעו מחדש את התאים במאגר קיבוע כדי להצליב חלבונים, לשמר את המורפולוגיה של התא ולהשבית את מיקובקטריות לטיפול בטוח במהלך הניתוח.
לבסוף, צנטריפוגה ועבד את הדגימות לזרימה ציטומטרית.
השתמש באסטרטגיית שער מתאימה כדי לקבוע את אחוז תת-האוכלוסיות הנגועות ב-Mycobacterium.
כדי לצבוע את התאים לצורך ציטומטריית זרימה, דגרו את התאים הנגועים ב-1 מיליליטר של מאגר FACS בתוספת 0.5 מילי-מולרי EDTA לבאר למשך 30 דקות לפחות. בתום הדגירה, אספו את התאים המנותקים עם פיפטינג עדין, והעבירו את התאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגות בודדים עם מכסה בורג לצנטריפוגה.
השעו מחדש את התאים בכ-50 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים אנטי-אנושיים מצומד פלואורוכרום וצבע כדאיות מעניין, ודגרו על התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מוגנים מאור.
לאחר הכביסה, יש לתקן את התאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר קיבוע טרי שהוכן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר המוגן מפני אור. לאחר הקיבוע והכביסה, השעו מחדש את התאים ב-400 מיקרוליטר של מאגר FACS, והעבירו את התאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1 מיליליטר.
כדי לנתח את התאים, השתמש בחרוזי פיצוי כדי לפצות על האות הפלואורסצנטי עבור כל נוגדן מצומד פלואורוכרום בקוקטייל, והשתמש בתאים לא מוכתמים כדי להגדיר את השער לאוכלוסיית התאים השליליים. לאחר מכן, רכשו מינימום של 50,000 תאים לדגימה.