בדיקת מבחנה לחקר היכולת ציטוטוקסית של תאי הרג הנגרמים על ידי ציטוקינים

קחו תרבית של תאים סרטניים עם חלבונים ציטופלזמיים עם תווית פלואורסצנטית.

הוסף תאי רוצח או CIK המושרים על ידי ציטוקינים - תאי T אפקטורים עם מאפיינים דמויי תאי הרג טבעיים - בעלי פעילות אנטי-גידולית.

קולטני D או NKG2D מקבוצת הרג טבעית 2 בתאי CIK נקשרים לחלבונים המעוררים לחץ על תאי הסרטן.

הקישור גורם לתאי CIK לשחרר רעלני גרגירים ציטופלזמיים - פרפורינים וגראנזימים.

פרפורינים יוצרים נקבוביות בקרום התא הסרטני, ומאפשרים כניסת גרנזימים, המפעילים קספאזות וגורמים לאפופטוזיס.

לאחר הדגירה, קצרו את התאים. הוסף צבע כדאיות תא קושר חומצות גרעין פלואורסצנטיות.

הצבע נכנס דרך קרום התא הפגוע ונקשר ל-DNA, וכתוצאה מכך תאים מתים מוכתמים כפולים.

עם קרום תא שלם, תאים חיים אטומים לצבע.

העבירו את התאים דרך ציטומטר זרימה כדי לזהות תאים חיים המציגים פלואורסצנטיות בודדת ותאים מתים עם פלואורסצנציה כפולה.

צור תרשים פיזור כדי למדוד את אחוז תאי הסרטן המתים, לכמת את ההשפעה הציטוטוקסית של תאי CIK.

כדי לבצע את הבדיקה הציטוטוקסית, תרבית משותפת CIK ותאי לוקמיה מיאלואידית כרונית אנושית K562, על ידי הוספת 1 מיליליטר של תאי K562 לכל באר בצלחת של 6 בארות בצפיפות של 0.5 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר של מדיום בסיסי עם או בלי תאי CIK לצלחת 6 הבארות, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. מערבבים את מתלי התאים על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים.

מניחים את הצלחת בחממה למשך 24 שעות. כעת, תרבית משותפת של תאי CIK ותאי OC-3 בשחלות על ידי הוספת 1 מיליליטר של מדיום בסיסי עם או בלי תאי CIK לצלחת 6 הבארות, כפי שמפורט בפרוטוקול הטקסט. מערבבים את מתלי התאים על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים עם הלהב בחממה למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, קצור את תרחיף התאים CIK-K562 ישירות לתוך צינור סטרילי של 15 מיליליטר.

כדי לקצור הן את התרחיף והן את התאים הדבקים מקבוצות CIK-OC-3, ראשית, העבירו את תרחיף התאים לצינור סטרילי של 15 מיליליטר. שוטפים את הבאר עם 1 מיליליטר PBS סטרילי. אוספים את ה-PBS ומוסיפים אותו לצינור. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר של תמיסת אנזים דיסוציאציה של תאים, ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

הוסף 1 מיליליטר מהתמיסה מאותו צינור לבאר המתאימה, וערבב בעדינות את התאים על ידי פיפטה למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים עם פיפטה סטרילית של 1 מיליליטר. אסוף את כל התאים באותו צינור. צנטריפוגה בחום של 300 x גרם למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS סטרילי. גלולה את התאים ב -300 x גרם למשך 10 דקות. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של PBS סטרילי.

הוסף 5 מיקרוליטר של צבע 7-AAD לתרחיף התא. מערבבים בעדינות את התאים על ידי פיפטה למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים עם פיפטה סטרילית של 1 מיליליטר. דוגרים למשך 10 דקות, ומשאירים בחושך לפני הניתוח.

כדי לבצע את בדיקת היכולת הציטוליטית, מערבבים את תרחיף התאים וחוזרים על ההכנה לזרימה ציטומטרית. לחץ על כפתור הדגימה החדשה כדי להוסיף דגימה וצינור לניסוי. תן שם לצינורות כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

כדי ליצור מערכת שער פיזור לבדיקה הציטוליטית, ראשית, בחר צינור 1 ולחץ על כפתור עלילת נקודה. כדי ליצור תרשים FSC-A/SSC-A, צייר שער מלבן מעל כל האירועים עם סף FSC-A גדול מ-50,000 כדי לא לכלול פסולת תא. בחר את הפרמטר SSC-A/CFSE עבור תרשים הנקודות החדש. לאחר מכן, בחר את הפרמטר 7-AAD/CFSE עבור תרשים הנקודות החדש, וצייר שער של ארבעה רבעים כדי להגדיר את ארבע תת-האוכלוסיות.

לחץ על טען דגימה כפתור כדי לנתח תחילה את דוגמת הבקרה הריקה. התאם את כרךtage של SSC-A ו-FSC-A. זהה את אוכלוסיית התאים המתים באמצעות פרמטרי ערוץ CFSE ו-7-AAD. רשום את הנתונים מיותר מ-20,000 תאים חיוביים ל-CFSE בכל דגימה. פתח את הקבצים המכילים את הערכים הסטטיסטיים של כל דגימה בודדת כדי לנתח את אוכלוסיות התאים הלא קיימות, וייצא את הנתונים לקבצי ניתוח.