אינדוקציה של דלקת מעיים נמקית במודל אנטרואיד אפיתל אנושי

השג קריפטות אנושיות שמקורן ברקמת המעי הדק - פלישות צינוריות המכילות תאי גזע וסוגים שונים של תאי אפיתל.

הוסף את קריפטות המעיים למטריצת מרתף צוננת.

העבירו את התערובת הזו לצלחת מרובת בארות, וצרו כיפה תלת מימדית.

הוסף מצע גידול ודגירה.

תאי גזע מתארגנים בעצמם, מתרבים ומתמיינים למספר סוגים של תאי מעיים, ויוצרים אנטרוספירה.

עם הזמן, האנטרוספירות מבשילות לאנטרואידים - מבנים תלת מימדיים המתחדשים מעצמם, הדומים לקריפטות המעי.

הוסף ליפופוליסכרידים, או LPS, אנדוטוקסין חיידקי, לבאר המכילה אנטרואיד ודגר.

מולקולות LPS נקשרות לקולטן דמוי האגרה באנטרואיד, ויוזמות תגובה פרו-דלקתית, וכתוצאה מכך הצטברות של מיני חמצן תגובתיים. זה מעורר שרשרת של אירועים המובילים לאפופטוזיס.

כתוצאה מכך, שלמות האנטרואיד נפגעת, מה שמוביל לחדירת LPS ללומן, מה שמעצים עוד יותר את התגובה הדלקתית.

זה מחקה התפתחות של דלקת מעי נמקית, דלקת קשה במעיים של פגים.

בזמן האיסוף בסוויטה הניתוחית, הנח את דגימת רקמת המעי הדק האנושית ב-DPBS קר. שטפו את הדגימה ב-DPBS הקר עד שהיא נקייה מדם וצואה.

אחסן את הדגימה במדיום RPMI 1640 בארבע מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה לבידוד קריפטה. כאשר אתה מוכן להמשיך, בדוק שוב כדי לוודא שהדגימה נקייה מצואה ודם. בעזרת מספריים מנתחים עדינים, הסר עודפי שומן או קליפסים וסיכות כירורגיים. שקלו את הדגימה, וכוונו לחתיכה שמשקלה כ-0.75 עד 2.5 גרם.

לאחר מכן, חותכים את הרקמה לחתיכות של 0.5 סנטימטר, ומניחים אותם בצינור המכיל 30 מיליליטר של מאגר כלאט #1. לנער במהירות נמוכה במשך 15 דקות בחום של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סנן את הרקמה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר, והשליך את הזרימה.

הוסף את הרקמה המסוננת לצינור המכיל 30 מיליליטר של מאגר כלאט #2. לנער במהירות נמוכה במשך 15 דקות בחום של ארבע מעלות צלזיוס. סנן את הרקמה דרך מסנן של 100 מיקרומטר, והשליך את הזרימה.

לאחר מכן, הפשירו 500 מיקרוליטר של מטריצת קרום הבסיס על קרח לשימוש מאוחר יותר. הוסף מעט רקמה ל -10 מיליליטר DMEM קר בצינור חרוטי של 50 מיליליטר, ונער במרץ ביד במשך 10 שניות. סנן את המתלה הזה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר, ואסוף את הזרימה. שמור את השפופרת הזו על קרח.

הוסף מעט רקמה לעוד 10 מיליליטר של DMEM קר בצינור חרוטי נפרד של 50 מיליליטר, ונער במרץ ביד במשך 10 שניות. סנן את המתלה הזה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר, ואסוף את הזרימה.

חזור על תהליך זה פעמיים נוספות עד שיהיו ארבעה צינורות חרוטיים המכילים זרימה דרך המסומנים אחד עד ארבע. לאחר מכן, סנן את התמיסה בשפופרת מספר אחת דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר, והעביר את הזרימה לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר המסומן גם הוא מספר אחת. חזור על תהליך זה עבור צינורות שתיים עד ארבע.

צנטריפוגה של צינורות 15 מיליליטר ב -200 פעמים גרם ובארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. במכסה זרימה למינרית, הסר את הסופרנטנט מכל צינור, והשליך אותו. הימנעו מלשבש את ענן הרקמה שמעל הגלולה, גם אם זה אומר להשאיר קצת סופרנטנט מאחור. בכל צינור, פיפטה למעלה ולמטה לאט כדי לערבב את הגלולה עם שאריות הסופרנטנט.

מעבירים את התערובת מכל צינור לצינור חרוטי יחיד של 2 מיליליטר, וצנטריפוגה בחום של 200 פעמים גרם ובארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב -500 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף מופשרת מראש.

השתמש בקצה פיפטה צונן כדי למרוח 50 מיקרוליטר של מתלה זה על מרכז באר בצלחת של 24 בארות. דגימה זו צריכה להיראות בצורת כיפה. חזור על תהליך הגשת בקשה זה תשע פעמים כדי למלא 10 בארות בסך הכל.

העבירו את צלחת 24 הבארות לחממת פחמן דו חמצני של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר פילמור. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של מיני-מדיית מעיים אנושית לכל באר. המשיכו לדגור באותם תנאים, והקפידו להחליף את המדיה הזו כל יומיים.