איתור קישור ויטרונקטין למשטחים חיידקיים באמצעות ציטומטריית זרימה

קח צינורות ציטומטר זרימה המכילים זנים פראיים ומוטנטיים של המופילוס אינפלואנזה, סוג f.

פיפטה, חוצץ המכיל חלבונים חוסמים וויטרונקטין דגירה.

החלבונים החוסמים מפחיתים אינטראקציות לא ספציפיות על פני השטח של החיידקים, בעוד שמולקולות ויטרונקטין נקשרות לחלבון H, חלבון קושר ויטרונקטין, על משטחי חיידקים מסוג בר. בזן המוטנטי, ויטרונקטין אינו נקשר בגלל היעדר חלבון H.

צנטריפוגה. הסר ויטרונקטין לא קשור וחלבונים חוסמים.

הוסיפו חוצץ המכיל נוגדנים ראשוניים נגד ויטרונקטין, הנקשרים באופן ספציפי לויטרונקטין המחובר למשטחי החיידקים מסוג הבר.

לאחר מכן, הציגו נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור, הנקשרים לנוגדנים הראשוניים על ויטרונקטין ומקלים על זיהוי ויטרונקטין.

צנטריפוגה. הסר נוגדנים משניים לא קשורים. השעו מחדש חיידקים במאגר.

בצע זרימה ציטומטרית כדי לקבוע את קשירת ויטרונקטין למשטח החיידקים.

השווה את אותות הקרינה של זנים מסוג בר וזנים מוטנטיים. שינוי באות הקרינה בחיידקים מסוג בר מאשר את קשירת הוויטרונקטין לפני השטח של החיידקים.

כדי להתכונן לזרימה ציטומטרית, השעו מחדש את כדורי החיידקים עם 50 מיקרוליטר של מאגר חוסם המכיל 250 ננו-מולרי ויטרונקטין לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך שעה בטמפרטורת החדר מבלי לנער. לאחר הדגירה, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב-3,500 x גרם למשך 5 דקות. לאחר מכן שטפו את הכדורים שלוש