הערכה של זרחן חלבוני תוך-תאי המושרה על ידי ציטוקינים סטרומה באמצעות ציטומטריה של זרימת זרחן

קח תאי לוקמיה במצע גידול ללא גורמים מגרים כמו ציטוקינים, ודגר עליהם.

היעדר גורמים מעוררים מאפשר לחלבונים זרחניים תוך-תאיים לעבור דה-פוספורילציה ולחזור למצבם הטבעי.

צנטריפוגה והסר את המדיה. השעיה מחדש של תאים בסטרומה סופרנטנט המכיל את הציטוקין, לימפופויטין סטרומלי תימי או TSLP.

TSLP נקשר לקולטן שלו בתא הלוקמיה, וגורם לדימריזציה של הקולטן.

זה מקרב את שני הקינאזות הקשורות ליאנוס, או JAKs, מה שמקל על טרנספוספורילציה הדדית.

ה-JAKs המופעלים מזרחנים את הזנבות הציטופלזמיים של הקולטן, ויוצרים אתרי עגינה למתמר אותות ומפעיל שעתוק, מונומרים STAT.

לאחר הזרחון, STATs מתעמעמים ומתנתקים מהקולטן כדי לווסת תהליכים תאיים במורד הזרם.

תקן את התאים כדי לשמור על מצבי הזרחן של חלבונים תוך-תאיים.

טפל בתאים בתמיסת חדירות כדי להגביר את חדירות קרום התא.

הוסף נוגדנים עם תווית פלואורסצנטית כדי לסמן את החלבונים הזרחניים.

מדידת זרימה-ציטומטרית של אות הקרינה נמצאת בקורלציה עם זרחון STAT המושרה על ידי TSLP.

כדי לאמת את הסופרנטנט המופק מסטרומה מהונדסת, יש להפשיר את דגימות הסופרנטנט שנאספו מהבקרה בסטרומה המבטאת ציטוקין, וצלחת 3 בארות של קווי תאי לוקמיה לכל מצב במדיום R20 בריכוז של 2 כפול 10 עד 5 תאים לבאר בצלחת תרבית רקמה של 96 בארות. דגרו על התאים במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לזרחון מהתרבית הקודמת שלהם לאבד.

לאחר מכן, העבירו את התאים מכל באר לצינורות בודדים של 4 מיליליטר, ואספו את התאים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הכדורים ב-600 מיקרוליטר לכל מצב ניסוי, וצלחו 200 מיקרוליטר תאים לבאר עבור כל מצב בשלוש עותקים. לדגור את התאים לתקופה המתאימה בהתאם לבדיקת הפוספו המסחרית הספציפית.

בתום הדגירה יש לגלול את התאים בצנטריפוגה, ולסמן את התאים באמצעות צביעת פוספו-זרימה ציטומטרית לפי פרוטוקול היצרן. לאחר מכן, נתח את התאים על ידי זרימה ציטומטרית באמצעות פרוטוקולי ניתוח ציטומטרי זרימה סטנדרטיים כדי לוודא שציטוקין בסטרומה סופרנטנט זרחן את תאי הלוקמיה.