הדמיה של חיידקים במקטעי ביופסיה של שלפוחית השתן באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו

התחל עם מגלשת זכוכית הנושאת קטע ביופסיה של רקמת שלפוחית השתן נגועה ונטולת שתן מיובשת המכילה חיידקים אורופתוגניים.

הציגו בדיקות אוניברסליות עם תווית פלואורסצנטית - אוליגונוקלאוטיד חד-גדילי משלים ספציפי לאזור השמור של RNA ריבוזומלי חיידקי 16s, או 16s-rRNA.

דגרו את המגלשה בחושך בטמפרטורה גבוהה להכלאה אופטימלית.

במהלך הדגירה, הבדיקות עוברות הכלאה בלעדית לאזור השמור על חיידקים 16s-rRNA, ומעניקים פלואורסצנטיות ירוקה לחיידקים.

לאחר הכלאה, יש לשטוף עם מאגר מחומם מראש כדי להסיר את הבדיקות הלא קשורות.

צבעו את קטע הרקמה בצבע Hoechst ובסמני חלבון תאיים עם תווית פלואורופור.

מולקולות הוכסט נקשרות ל-DNA, וצובעות את הגרעינים בכחול, בעוד שסמנים המסומנים בפלואורופור מקיימים אינטראקציה עם רכיבי תא ספציפיים כגון חוטי מוצין ואקטין, ומעניקים פלואורסצנטיות אדומה בקטע הביופסיה.

שטפו את השקופית והוסיפו אמצעי הרכבה לחלק הרקמות.

תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, פלואורסצנציה ירוקה בתוך קטע ביופסיית שלפוחית השתן הנושאת פלואורסצנטי אדום מאשרת את החיידקים הקשורים לרקמה.

הכן תא לחות לכל בדיקה על ידי הוספת מגבון משימות ספוג, מקומט ועדין ומים סטריליים למאגר של קופסת טיפים P1000. הנח את מחסנית מחזיק הקצה למעלה, מכיוון שכאן יושבים השקופיות. בסיום הכביסה הסופית, הסר את השקופית ממתלה השקופיות, והנח אותם על מגבת נייר טרייה, כשצד הטישו כלפי מעלה. השתמש במגבון משימה עדין כדי לייבש את המגלשה, והקפד לטפוח בעדינות רק ליד אך לא על קטע הביופסיה כדי לנדף את המים. בעזרת עט הידרופובי, צייר גבול סביב קטע הביופסיה, והנח את רקמת השקופית כלפי מעלה בתא הלחות.

לאחר מכן, הכניסו את תא הלחות לחממה המוגדרת ל -50 מעלות צלזיוס. פיפטה בין 50 ל-150 מיקרוליטר של תמיסת הצביעה ישירות על גבי הרקמה כך שהמלבן שנוצר על ידי הגבול ההידרופובי סביב הרקמה מתמלא, וסגור את הקופסה בעדינות. דגירה למשך הלילה בחום של 50 מעלות צלזיוס בחושך. אם לחממה יש חלון, כסו אותו בנייר אלומיניום ליצירת סביבה חשוכה.

למחרת בבוקר, הסר את השקופיות מתאי הלחות, ונדף במהירות כל פתרון הכלאה שנותר בעזרת מגבון משימה עדין. לאחר מכן, הנח את השקופיות לתוך מתלה מכתים אנכי. הנח את מתלה הצביעה בצנצנת קופלין עטופה בנייר אלומיניום המכילה 100 מ"ל ממאגר הכביסה שחומם מראש למשך 10 דקות. חזור על שלב כביסה זה פעמיים נוספות עם מאגר כביסה טרי בצנצנות קופלין חדשות.

במהלך שלבי הכביסה הללו, הכינו את הכתם הנגדי על ידי דילול תמיסת מלאי של Hoechst 33342 במאגר כביסה ביחס של 1 ל-1,000. לאותו צינור, הוסף את נבט החיטה Alexa-555 agglutinin לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר ואת Alexa-555 phalloidin לריכוז סופי של 33 ננו-מולארי. יש לאחסן בחושך עד שמוכן לשימוש.

בסיום הכביסה הסופית, הסר את השקופיות מצנצנת הקופלין, והסר בעדינות את כל מאגר הכביסה העודף בעזרת ניגוב משימה עדין. הניחו את השקופיות עם צד הרקמה כלפי מעלה על מגבת נייר, והוסיפו בין 50 ל-150 מיקרוליטר של כתם נגדי ישירות על גבי הטישו כך שהגבול ההידרופובי יתמלא אך לא יעלה על גדותיו. כסו עד ארבע שקופיות עם חלק עליון של קריובוקס, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר מכן, החזירו את השקופיות לרשת הצביעה, ושטפו אותן פעמיים נוספות בצנצנות קופלין המכילות מאגר כביסה טרי, כאשר כל שטיפה נמשכת 10 דקות. לאחר מכן, יבשו היטב את השקופיות, והניחו אותן עם הרקמה כלפי מעלה על מגבת נייר מתחת לחלק העליון של קריובוקס. סחטו טיפה אחת של אמצעי הרכבה ישירות על גבי הטישו, והניחו בעדינות כיסוי בגודל מתאים מעל. בעדינות, לחץ החוצה את כל הבועות, ואפשר למגלשות שהחליקו על הכיסוי להתרפא למשך הלילה בחושך. למחרת, אטמו את שולי הכיסויים למגלשה בשכבה בהירה של לק שקוף, והניחו להתייבש בחושך למשך 10 דקות, לפני שמאחסנים אותם בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

כאשר אתה מוכן לצלם את הביופסיות המוכתמות, הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי ואת התוכנה המשויכת למיקרוסקופ. התחל עם שקופית חיובית ל-FISH ועבור למצב הדמיה ממוחשבת. בחר את הערוצים עבור 405, 488 ו- 555. הגדר את חור הסיכה באמצעות ערוץ אורך הגל הארוך ביותר, שבמקרה זה הוא 555. לאחר מכן, מצא את מישור המוקד הנוכחי להדמיה של חיידקים מסומנים בערוץ 488. מבלי לשנות את מישור המוקד, הגדר את ההגבר, עוצמת הלייזר וההיסט עבור כל ערוץ, כך שהאות לא יהיה רווי, והרקע לא יתוקן יתר על המידה. רכוש את התמונה בכל שלושת הערוצים.