JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:54 דק' • July 8th, 2025
קח השעיה של תאי ג'ורקט - תאי לוקמיה לימפוציטים T.
ערבבו אליקוט עם צבע כדאיות התא והבטיחו מספר הולם של תאים חיים.
צלחת את התאים בצלחת תרבית ומרחו קרינה אולטרה סגולה C או UVC, למשך הזמן הנדרש.
UVC חודר לתאים ונספג על ידי ה-DNA, ויוצר תוצרי פוטו פירימידין.
לאחר הקרנה, דגרו על התאים. נזק נרחב ל-DNA בתיווך UVC מתחיל את מסלול האפופטוזיס הפנימי, ומפעיל חלבונים פרו-אפופטוטיים על הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית.
חלבונים מופעלים עוברים אוליגומריזציה, יוצרים נקבוביות ממברנה ומשחררים ציטוכרום C מהחלל הבין-ממברני לציטופלזמה.
קומפלקסים של ציטוכרום C עם הפרוטאז האפופטוטי המפעיל פקטור-1, ויוצרים קומפלקס אפופטוזום. האפופטוזום מפעיל קספאזות וגורם לאפופטוזיס.
הציגו את נספח V עם התווית פלואורופור כדי לסמן פוספטידילסרין על הממברנה, סמן תא אפופטוטי, והוסיפו פרופידיום יודיד שנכנס דרך הממברנה הפגועה כדי לסמן את ה-DNA.
באמצעות ציטומטריית זרימה, קבע את התאים האפופטוטיים המוקדמים המסומנים בנספח V ותאי אפופטוטיקה מאוחרים מוכתמים כפולים.
התחל בתרבית תאי T של ג'ורקאט במדיום תרבית תאי בסיס, בתוספת לפי הוראות כתב היד, ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. תאי T של ג'ורקאט הם קו תאי הרחקה שניתן לשמור עליו באמצעות מעבר למצע תרבית מחומם מראש כל שלושה ימים.
הכן תאים אפופטוטיים על ידי גידולם למפגש של 90%, שלוקח שלושה עד ארבעה ימים לאחר המעבר. לגדל תאים בחמש צלוחיות T75, כדי להשיג מספר מספיק של תאים לפרוטוקול זה. לאחר שהתאים מוכנים, שאפו את תכולת הבקבוק כ-24 מיליליטר, והעבירו אותם לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. ספרו את התאים באמצעות צביעה כחולה טריפן והמוציטומטר.
גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב -271 פעמים גרם למשך חמש דקות, והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים במדיה כדי להשיג שלושה מיליון תאים למיליליטר. הציגו את התאים לצלחות תרבית רקמה בגודל 100 על 20 מילימטר על ידי העברת חמישה מיליליטר תאים למנה.
הכינו כתשע מנות תרבות. הניחו מנה אחת בצד כבקרה לא חשופה, וחשפו את הכלים הנותרים לקרינת UV. הגדר את הצלב UV לרמת האנרגיה הנכונה על ידי לחיצה על כפתור האנרגיה והזנת "600" עם לוח המספרים. הקרינו את כל הכלים עם התאים למעט הביקורת, והקפידו להסיר את הכיסוי העליון של צלחת תרבית הרקמה במהלך חשיפה ל-UV.
לאחר מכן, דגרו את כל המנות בחממת תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך ארבע שעות. לאחר הדגירה, שלבו את כל התאים המוקרנים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, וגלו אותם על ידי צנטריפוגה ב-271 פעמים גרם למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-24 מיליליטר של PBS סטרילי. צנטריפוגה שוב את הצינור, והסר את הסופרנטנט.