הדמיה ברזולוציית על של היווצרות סינפסה אימונולוגית של תאי NK על דו-שכבה ליפידית נתמכת

הכן שקופית תא עם שכבת שומנים דו-שכבתית, או SLB, המורכבת מפוספוליפידים ופוספוליפידים ביוטיניליים.

הוסף חלבונים חוסמים כדי למנוע אינטראקציות לא ספציפיות.

הכניסו סטרפטווידין, שנקשר לפוספוליפידים ביוטיניליים.

הוסף נוגדנים נגד CD16 ביוטיניליים עם תווית פלואורסצנטית, הנקשרים לסטרפטווידין המשותק.

פיפטה D-ביוטין למניעת קשירה לא ספציפית של סטרפטווידין לתאים.

הכניסו תאי הרג טבעיים, או NK. קולטני CD16 בתאים אלה נקשרים באופן ספציפי לנוגדנים נגד CD16 הקשורים ל-SLB, ויוצרים סינפסה אימונולוגית.

קשירה זו מפעילה סידור מחדש של אקטין וקיטוב מיקרו-צינורות, ובסופו של דבר יוצרת מיקרו-אשכולות במרכז הסינפסה המכילים נוגדנים נגד CD16 הקשורים ל-SLB וקולטני CD16.

גרגירים ליטיים המכילים פרפורין מקטבים וחודרים דרך חוטי אקטין בסינפסה.

תקן את התאים. לחדור את הממברנות ואת SLB.

הוסף נוגדנים פלואורסצנטיים ואנטי-פרפורין, הנקשרים לחוטי אקטין ופרפורין, בהתאמה.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה, דמיין את התפלגות חוטי האקטין הפלואורסצנטיים והגרגירים החיוביים לפרפורין בסינפסה.

כדי להרכיב את שכבת השומנים המישורית הנתמכת בזכוכית, ראשית, הכינו 100 מיליליטר תמיסת פיראנה על ידי ערבוב של 30% מי חמצן עם חומצה גופרתית ביחס של 1 עד 3 בכוס. לתוך תמיסה זו, הניחו שני כיסויים מלבניים #1.5 למשך 20 עד 30 דקות. בזמן ניקוי הכיסויים, יש לשלוף שפופרת אחת של שומני DOPC של 400 מיקרו-מולרים שהוכנו בעבר, ושפופרת אחת של שומני ביוטין-PE של 80 מיקרו-מולרים שהוכנו בעבר. העבירו אותם על קרח למיכל הארגון.

לאחר ביטול חמצון של צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש עם ארגון, הוסף יחד את ה-DOPC ואת הביוטין-PE ביחס של 1 ל-1. הנפח הספציפי ישתנה בהתאם לצרכי הניסוי, אך צריך להיות, לכל הפחות, 2 מיקרוליטר כל אחד. יש לחמצן את צינור התערובת ואת צינורות הריאגנטים האישיים לפני החזרת האחרונים למקרר.

לאחר סיום הניקוי, יש לשטוף היטב את הכיסויים במים מזוקקים. הנח את הכיסויים לייבוש באוויר למשך מספר דקות. לאחר מכן, משוך 1.5 מיקרוליטר מתערובת הליפוזום, והכניס אותה בטיפה אחת לאחד מתאי הנתיב של מגלשת תא. השימוש בשתי טיפות לכל נתיב הוא אופייני אך לא הכרחי.

כעת, הנח במהירות וביעילות את הכיסוי היבש מעל הטיפות. ודא שהטיפות מרווחות מספיק כדי שלא יתמזגו לאחר הנחת הכיסוי. יתר על כן, וודאו כי הטיפות יישארו עגולות ומוגדרות היטב, מבלי לגעת בשולי קירות החדר. לחץ כלפי מטה בחוזקה, בין ומסביב לכל נתיב, כדי להבטיח אטימה אטומה למים בין החלקת הכיסוי למגלשה.

סמן את מיקומי הטיפות בעזרת עט טוש. לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר של קזאין מימי של 5% דרך החדר כדי לחסום את השכבה הדו-שכבתית. נסו לוודא שאין בועות בתא הזרימה. לאחר מכן, הזריק 100 מיקרוליטר סטרפטווידין בריכוז של 333 ננוגרם למיליליטר לכל נתיב.

לאחר הדגירה במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר, יש לשטוף על ידי הזרמת 3 מיליליטר של מי מלח עם 1% אלבומין בסרום אנושי בכל נתיב כדי להסיר את עודפי הסטרפטווידין. הוסף 100 מיקרוליטר של אנטי-CD16 ביוטינילית, המסומנת פלואורסצנטית בריכוז החלבון שנקבע קודם לכן, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר הדגירה בחושך במשך 20 עד 30 דקות, יש לשטוף שוב על ידי הזרמת 3 מיליליטר של מי מלח עם 1% אלבומין בסרום אנושי בכל נתיב. לאחר מכן, הזרימו 100 מיקרוליטר של D D-ביוטין בריכוז של 25 ננו-מולר דרך התא על מנת לקשור כל עודף סטרפטווידין, ובכך לבטל את הסיכוי לקשירה לא ספציפית של סטרפטווידין לתאים.

לאחר מכן, ספרו תאי NK אנושיים, והשעו אותם מחדש בריכוז של 500,000 למיליליטר בתמיסת מלח עם HEPES עם 1% אלבומין בסרום אנושי. שטפו את ה-D-ביוטין מהתא עם עוד 3 מיליליטר של מי מלח עם חוצץ HEPES עם 1% אלבומין בסרום אנושי לכל נתיב. לאחר שהתאים הושעו מחדש בריכוז הרצוי, הוסף 100 מיקרוליטר לכל נתיב. הנח את החדר בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 30 עד 60 דקות.

לאחר תקופת דגירה זו, יש לתקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 20 דקות. שטפו על ידי הזרמת 3 מיליליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט בכל נתיב כדי להסיר את הפרפורמלדהיד. לאחר מכן, הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר חוסם לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר מכן, צבעו F-actin ופרפורין על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של פלואידין מדולל ומסומן פלואורסצנטי ונוגדנים חד שבטיים נגד פרפורין. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה לפני הכביסה על ידי הזרמת 3 מיליליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט דרך החדר. החדר מוכן להדמיה.

כדי להתחיל, הפעל את כל מודולי החומרה הדרושים של מיקרוסקופ STED. הפעל את תוכנת ניתוח התמונה והפעל גם סריקת תהודה וגם מודולי STED. לאחר ביצוע בחירות אלה, המתן כשלוש עד חמש דקות עד שהתוכנה תתחיל.

לחץ על הכרטיסייה תצורה בחלק העליון של המסך. בחר תצורת לייזר. לאחר מכן, הפעל את האור הלבן ואת הלייזרים STED 592 ננומטר. בחר את המטרה 100X, ויישר את קרן לייזר העירור עם לייזר דלדול של 592 ננומטר. בחר את מודול תצורת הלייזר. כבה את לייזר הדלדול 592, והפעל את לייזר הדלדול של 660 ננומטר.

הנח את השקופית על ה-stagמעל העדשה. הבא את התאים הקשורים באזור הדו-שכבתי המסומן למיקוד באמצעות מנורת האור הלבן והעיניות. לאחר מכן, חזור לכרטיסייה רכישה ישירות משמאל לכרטיסייה תצורה. לחץ על הכרטיסייה עבור לאור לבן ולאחר מכן הפעל מודול זה וגרור את קו לייזר העירור לאורך הגל המתאים.

לאחר בחירת הגלאי הרצוי והגדרת טווח הזיהוי, לחץ על כפתור רציף בסרגל הכלים השמאלי Acquire כדי להעלות את תיבת הדו-שיח של סריקה רציפה בתחתית סרגל הכלים השמאלי. זה מאפשר למשתמש להוסיף מספר רצפים, כל אחד עם קרן עירור שונה לצבע אחר. לחץ בין פריימים ולאחר מכן, הגדר את תדירות העירור, הגלאי וטווח הזיהוי עבור כל צבע נוסף. לאחר אופטימיזציה של כל ההגדרות, לחץ על התחל כדי להתחיל בתהליך הרכישה.