הערכת ציטוטוקסיות ותקינות הממברנה בפרוסות ריאה באמצעות בדיקת לקטט דהידרוגנאז

התחל עם פרוסות ריאה אנושיות שנחתכו במדויק, PCLS, שטופלו בחומרים ציטוטוקסיים כמו מולקולות פעילי שטח בצלחת מרובת בארות.

חומר פעילי השטח מוחדר לשכבת השומנים הדו-שכבתית של התא, וגורם לזנבות ההידרופוביים של פעילי השטח לקיים אינטראקציה עם הליבה ההידרופובית של שכבת השומנים הדו-שכבתית.

כתוצאה מכך, הסידור המסודר של מולקולות השומנים מופרע, מה שמוביל להיווצרות מיצלה.

זה פוגע בשלמות הממברנה, וגורם לדליפה של תוכן תוך תאי כולל לקטט דהידרוגנאז או LDH, אינדיקטור נפוץ לנזק לקרום התא.

אסוף את הסופרנטנט המכיל את ה-LDH המשוחרר.

הוסף את קוקטייל תגובת בדיקת LDH המכיל מצע לקטט, NAD+, דיאפוראז ומלח טטרזוליום, והדגירה.

LDH מחמצן לקטט לפירובט, עם הפחתה בו-זמנית של NAD+ קו-אנזים ל-NADH.

דיאפוראז משתמש ב-NADH כדי להפחית את מלח הטטרזוליום לפורמאזאן - מוצר צבעוני.

ניתן למדוד ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי פעילי שטח מפעילות LDH המצוינת על ידי ייצור הפורמזן.

לאחר הדגירה של ה-PCLS עם או בלי חומרי בדיקה, העבירו 50 מיקרוליטר של סופרנטנט וכפילויות לצלחת חדשה של 96 בארות. זה מייצר כפילויות מכל באר מטופלת של צלחת של 24 בארות.

מיד לפני הבדיקה, הכינו תערובת מאסטר של תמיסת העבודה של מגיב LDH על ידי ערבוב יסודי של 125 מיקרוליטר של תמיסת זרז עם 6.25 מיליליטר תמיסת צבע לצלחת של 96 בארות. לאחר מכן, פיפטה 50 מיקרוליטר מתמיסת העבודה של תערובת המאסטר לכל באר שכבר מכילה 50 מיקרוליטר סופרנטנט, ודגרה על הצלחת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, מדוד את הספיגה של כל באר ב-492 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות, והפחית את הספיגה ב-630 ננומטר מזה של 492 ננומטר.