בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות המשתמשת בלימפוציטים מהונדסים לבדיקת תרכובות אימונומודולטוריות

התחל עם צלחת מרובת בארות תואמת פלואורסצנטית המכילה תרחיף של לימפוציטים T שמקורם בעכברים טרנסגניים.

לימפוציטים אלה מכילים חלבון פלואורסצנטי ירוק או קלטת ביטוי GFP, הנשלטת על ידי קולטן תאי T או מעורבות TCR עם תרכובות אימונומודולטוריות.

טפל בכל באר בתמיסה המכילה תרכובות אימונומודולטוריות בעלות פוטנציאל שונה.

במהלך הדגירה, תרכובות אימונומודולטוריות מקיימות אינטראקציה עם TCRs על לימפוציטים מסוג T.

אינטראקציה של TCR עם תרכובת מגרה מפעילה את הפעלת קלטת הגנים, ומעלה את ביטוי ה-GFP.

לעומת זאת, אינטראקציה של TCR עם תרכובת מעכבת מעכבת את קלטת הגנים ומפחיתה את ביטוי ה-GFP.

לאחר מכן, כיסו את התאים בצבע פלואורסצנטי של חומצת גרעין כדי לצבוע את הגרעינים.

צנטריפוגה את הצלחת כדי ליישב את התאים למדידת פלואורסצנטיות מדויקת.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לימפוציטים T ברי קיימא מציגים שני אותות פלואורסצנטיים המתאימים לגרעיני התא וחלבונים פלואורסצנטיים ירוקים.

הקרינה הירוקה המוגברת מסמלת גירוי מוצלח של לימפוציטים T, בעוד שאות פלואורסצנטי ירוק תוך-תאי חלש מאשר את ההשפעה המעכבת של תרכובות אימונומודולטוריות על לימפוציטים T.

לבדיקת תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות, צלחו 40 מיקרוליטר תאים לבאר בצלחת של 384 בארות, וטפלו בבארות המתאימות עם התרופה או הרכב המועדף לתקופת הטיפול הרצויה בחממת תרביות התאים.

30 דקות לפני ניתוח ה- GFP, יש לצבוע את התאים בריכוז המתאים של תמיסת Hoechst, ולהפיץ היטב את הכתם בפיפטינג עדין. כאשר כל הבארות נצבעו, צנטריפוגה את הצלחות כדי לאסוף את התאים בתחתית הבארות, ואפשרו לתאים לנוח במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

טען את הצלחת לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, הגדר את היעד ל-40X ומעלה. הגדר מצלמה מספר 4 עבור מנורת ה-UV ולאחר מכן הגדר מצלמה מספר 1 עבור לייזר 488. טען את הצלחת למערכת הסינון בעלת התכולה הגבוהה. לאחר מכן, הגדר את מערכת הסינון האוטומטית בעלת התוכן הגבוה לקריאת 6 עד 10 שדות לבאר, עם שתי קריאות עוקבות לכל שדה ב-488 ננומטר ואור UV.