טכניקת מבחנה לחקר אינטראקציה של תאי T עם דו-שכבות שומנים מישוריות נתמכות

קח שקופית זרימה המכילה שכבת שומנים דו-שכבתית, או SLB.

ה-SLB מצומד לליגנדים ספציפיים - מולקולת הידבקות בין-תאית 1 או ICAM-1 ונוגדנים נגד CD3 - המסומנים בפלואורופורים.

הוסף תאי T ואנטי-CD107a Fab מתויג פלואורופור - מקטע קושר האנטיגן של נוגדן כנגד סמן הדגרנולציה.

קומפלקס הקולטן של תאי T-CD3 או TCR-CD3 נקשר לנוגדנים נגד CD3, ומפעיל את ה-TCR.

איתות מבפנים החוצה המושרה על ידי הפעלה מפעיל אינטגרינים על פני השטח, הנקשרים ל-ICAM-1 המשותק.

ההצמדה גורמת לארגון מחדש של השלד הציטו-צינורי - סידור מחדש של מיקרו-צינוריות, ופילמור אקטין שמוביל להתפשטות רוחבית של התא על פני השטח של SLB.

ההתפשטות מאפשרת ליותר אינטראקציות של ליגנד-קולטן ליצור אשכול הפעלה סופרמולקולרי או SMAC, וליצור סינפסה חיסונית.

גרגירים ליטיים של תאי T נעים לאורך מיקרו-צינורות ומתמזגים עם קרום הפלזמה, וחושפים סמני דה-גרנולציה על פני התא, הנקשרים ל-Anti-CD107a Fab.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, דמיין את הסינפסה החיסונית המועשרת במתחמי TCR-CD3, אינטגרינים וסמני דה-גרנולציה.

התחל בשימוש במלקחיים מסוג מספריים מפוליפרופילן כדי לטבול כיסויי זכוכית בתמיסת פיראנה חומצית טרייה שהוכנה למשך 25 עד 30 דקות. בתום הכביסה, שטפו את הכיסויים שבע פעמים בנפח טרי של מים טהורים במיוחד לכל כביסה, והניחו את הכיסויים הרטובים בצד כדי לאפשר למים הנותרים להתגלגל מהכוס הנקייה.

כאשר הכיסויים יבשים, יש לשים שני מיקרוליטר מתערובת הליפוזום הסופית, בדיוק, במרכז תעלת שקופיות דביקה בתוך מכסה זרימה סטרילי, ומיד אך בזהירות, יישר כיסוי נקי ויבש אחד עם המגלשה כדי לאפשר להוריד את הכיסוי בעדינות על הצד הדביק של המגלשה, והשתמש בטבעת החיצונית של המלקחיים מסוג מספריים מפוליפרופילן כדי להפעיל לחץ עדין על המגע ההיקפי של החלקה עם המגלשה, וודא שההחלקה מחוברת היטב למגלשה כדי למנוע דליפה. לאחר מכן, הפוך את המגלשה והשתמש בטוש קבוע כדי לצייר ארבע נקודות סביב השכבה הדו-שכבתית בצד החיצוני של מכלול השקופיות.

לפני ההזרקה הראשונה, ייעד יציאה אחת של התעלה כפתח הכניסה והשנייה כיציאת היציאה, תוך שמירה על ייעוד זה לאורך כל הניסוי. כדי למנוע היווצרות בועות, הכנס את קצה קצה הפיפטה ישירות לפתח הכניסה עד שתרגיש את אטם הגומי של תעלת ההחלקה חודר עם הקצה.

לאט, מלאו את התעלה ב-50 מיקרוליטר של מאגר בדיקה חם. הזרקו 200 מיקרוליטר של ניקל (II) כלוריד בתמיסה חוסמת קזאין לתוך פתח הכניסה, והוציאו 50 מיקרוליטר של המאגר מיציאת היציאה. לאחר דגירה של 45 דקות, הסר את תמיסת הקזאין העודפת מיציאת היציאה.

הזרקו 100 מיקרוליטר של תמיסת ICAM-1 וסטרפטווידין לפתח הכניסה לדגירה של 45 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה, הסר את תמיסת החלבון העודפת מיציאת היציאה, ושטוף את השכבה הדו-שכבתית פעמיים עם 100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל שטיפה. לאחר מכן, סמנו את הדו-שכבות ב-100 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-CD3 מצומד פלואורופור למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שתי שטיפות ב-100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל שטיפה, כפי שהודגם.

כדי לדמות אינטראקציות דו-שכבתיות של תא T, הנח את השקופית על השלב המחומם של 37 מעלות צלזיוס של מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית כוללת, או TIRF, והתאם את השלב באמצעות סימני הדיו כדי למרכז את השכבה הדו-שכבתית על יעד הכוח של 100.

להדמיית שחרור גרגירים, הוסף שברי נוגדנים מצומדים נגד CD107a מצומדים פלואורסצנטיים לתרחיף תאי CD4 T, והשעו מחדש את התאים המסומנים ב-50 מיקרוליטר של מאגר בדיקה להזרקה ליציאת הכניסה של תעלת השקופיות. לאחר מכן, בחר את המספר המתאים של שדות ניסוי, והקלט תמונות של כל שדה אחת לדקה למשך 30 דקות לאחר ההזרקה.