טכניקת מבחנה לדמיין אקסוציטוזה של גרגרי הפרשה בתאי פיטום

קחו כיסוי עם תא המכיל תאי פיטום - תאי חיסון עם גרגירי הפרשה, או SGs, המכילים מתווכים דלקתיים.

הוסיפו נוגדנים IgE יחד עם מדווח פלואורסצנטי רגיש ל-pH, ודגרו.

הנוגדנים נקשרים לקולטני Fc בתאי פיטום. הכתבים מופנמים באמצעות פינוציטוזיס, והאנדוזומים המתקבלים מתמזגים עם SGs.

הסר את המדיה. הוסף אנטיגן המכיל מספר אפיטופים קושרי IgE; הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי, והחל את אורך גל העירור הנדרש.

ה-pH החומצי של SGs מרווה את הקרינה המדווחת.

האנטיגן נקשר לקומפלקסים של קולטני IgE על פני התא, ומקשר ביניהם.

צבירת קולטנים בתיווך אנטיגן מפעילה SGs לנדוד לעבר קרום הפלזמה.

חלבוני SNARE על הפלזמה וממברנת SG מתווכים היתוך ממברנה ופריקת מטען SG, המכונה אקסוציטוזיס.

ה-pH הגבוה יותר של המדיום גורם לאלקליזציה של SG, מה שגורם לכתבים להחזיר את הקרינה.

SGs נכנסים מתמזגים עם אלה המותכים בממברנה. אלקליזציה של ה-SG השני מתווכת התאוששות פלואורסצנטית, ומאשרת אקסוציטוזיס מורכבת.

הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכיסוי תא עם מצע תרבית טרי בתוספת FITC-dextran, וגדל את תאי ה-RBL בן לילה. ראשית, הכינו פתרון חיץ סופי של Tyrode בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הכינו מגיב הפרשה פי 20 במאגר הטרי.

ממיסים אבקת אמוניום כלוריד במאגר של Tyrode ליצירת תמיסת אמוניום כלוריד של 400 מילי-מולרי. לאחר מכן, שאפו את המדיה מזכוכית הכיסוי בתא, והחליפו אותה ב-300 מיקרוליטר של חוצץ Tyrode שחומם מראש. לאחר חזרה על תהליך הכביסה פעמיים, מלאו את החדר ב-300 מיקרוליטר של המאגר של Tyrode.

לאחר מכן, הנח את זכוכית הכיסוי בתא החממה של מיקרוסקופ, וודא שהתא יציב. הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי ובחר את מסנן הקרינה המתאים. ברגע שאזור העניין נמצא במוקד באמצע שדה הראייה, כבה את מקור האור.

לאחר מכן, הפעל את הלייזר של 488 ננומטר כשהפליטה נאספת בסביבות 500 עד 550 ננומטר. לאחר מכן, כייל את מרווח הזמן בין רכישת תמונה. הגדר את כיוון הסריקה ל"דו-כיווני". אל תאפשר חישוב ממוצע. פתח את חור הסיכה והגדר את הרזולוציה ל-512 על 512.

לאחר מכן, דמיין את התאים למשך הזמן המתאים לסוג התא הספציפי או להפרשה. לאחר מכן, הוסף לתא 16 מיקרוליטר מתמיסת ההפרשה והמשך לצלם. לבסוף, כדי לאשר את נוכחותו ולוקליזציה של FITC-dextan לגרגירי ההפרשה, הוסף בעדינות 16 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום כלוריד לתא.