תרבית חיידקים מסננת ריכוז חלבונים באמצעות מכשיר אולטרה-סינון

קח מכשיר סינון צנטריפוגלי בנפח גדול המכיל ממברנות תאית מחודשות אנכיות בגודל נקבוביות מתאים.

הוסף חיץ וצנטריפוגה. הסר את חומר הלחות הממברנה המכיל זרימה.

טען את המכשיר בחלבון תסנין תרבית חיידקים, או CFP, המקיף חלבונים מסיסים ושלפוחיות חוץ-תאיות, או EVs - מבנים קשורים לשומנים בגודל ננומטרי המכילים ביומולקולות המופרשות על ידי חיידקים.

במהלך צנטריפוגה, CFP עובר באופן משיק על פני הממברנות באמצעות כוח צנטריפוגלי.

ביומולקולות קטנות יותר מנקבוביות הממברנה עוברות עם נוזל תרבית, בעוד שגדולות יותר, כגון EVs, עוברות על פני הממברנה, וממזערות את סתימת הממברנה.

המסנן מרכז את ה-CFP לנפח מכשיר מינימלי, בסיוע נפח העצירה שלו כדי למנוע התייבשות ביו-מולקולה.

הוסף חיץ וצנטריפוגה.

המאגר מחליף רכיבי מדיה שיוריים, יוצר סביבה איזוטונית לביו-מולקולות CFP ושומר על שלמותן.

מניחים את התרכיז מעל המסנן, הופכים וצנטריפוגה. שחזר את שימור ה-CFP המרוכז להמשך ניתוח.

כדי להתחיל, הכינו מסנן צנטריפוגלי לניתוק משקל מולקולרי של 100 קילודלטון על ידי הוספת קיבולת הנפח המלאה של PBS. צנטריפוגה למשך חמש דקות ב -2,800 פעמים גרם ב -4 מעלות צלזיוס. השלך את הזרימה דרך, וכל PBS שנותר, ומלא את תא הדגימה ב-Mtb CFP עד לקיבולת המקסימלית שלו. צנטריפוגה ב-2,800 פעמים גרם ב-4 מעלות צלזיוס עד שהנפח יקטן לנפח המינימלי של מכשיר האולטרה-סינון. חזור על הפעולה לפי הצורך עד שהדגימה כולה צומצמה מספיק.

הוסף 1x PBS ליחידת המסנן המכילה את התרכיז עד לקיבולת הכוללת של המכשיר. הפחת את עוצמת הקול כמתואר קודם וחזור על שלב זה חמש פעמים כדי להבטיח כביסה מלאה והחלפת מאגר. לאחר מכן, שחזר את ה-CFP המרוכז ב-100 קילודלטון, או 100R, בהתאם למפרט מכשיר האולטרה-סינון. שטפו את המסנן בנפח מינימלי של 1x PBS לפחות שלוש פעמים, ומשכו את הכביסה עם ה-100R כדי למקסם את ההתאוששות.