טכניקת הפוטו-המרה לחקר דינמיקה של תאים דלקתיים בגלמי חרקים

התחל עם צלחת עם תחתית זכוכית המכילה גלמי דרוזופילה טרנסגניים הנושאים אפיתל פצוע מסומן עם חלבוני פני התא שלהם המציגים פלואורסצנטיות ירוקה.

תאי החיסון של הגלמים - או המוציטים מבטאים פלואורופורים ירוקים הניתנים להמרה בציטופלזמה וחלבונים פלואורסצנטיים אדומים בגרעין, מה שמקל על מעקב אחר התאים.

התאים הפצועים משחררים חומרים כימואטרקטיביים - או מולקולות דלקתיות, המושכים את ההמוציטים לאתר הפצוע.

מיקרוסקופיה קונפוקלית חושפת את האזור הפצוע המוקף בתאי אפיתל ירוקים.

במהלך הריפוי, המוציטים ירוקים עם גרעינים אדומים ליד הפצע מרחיבים את בליטות הממברנה - פילופודיה ולמליפודיה ונודדים לכיוון האזור הפצוע.

עם הזמן, כאשר החומר הכימואטרקטיבי מתפזר, המוציטים מרוחקים נודדים לעבר הפצע ויוצרים גל של תאים חיסוניים.

להאיר את תת-האוכלוסייה של המוציטים נודדים באורך גל של 405 ננומטר. זה ממיר באופן בלתי הפיך את הפלואורופור הניתן להמרה של ההמוציטים מירוק לאדום.

המוציטים אלה שהומרו לאור מתקנים את האפיתל הפצוע ומתרחקים מאתר הפצע, מבדילים את ההמוציטים המומרים לאור מהמוציטים שאינם מומרים לאור, ומבהירים את הדינמיקה של תאים דלקתיים.

לאחר פציעה בשולי כנפי האישון, העבירו במהירות את הצלחת עם תחתית הזכוכית למיקרוסקופ מתאים להדמיית זמן-lapse. לאחר מכן, פתח את תוכנת לכידת התמונות המתאימה.

בתוכנה, הפעל את הלייזרים המתאימים, והתאם את הכוח והיסט הרווח שלהם כדי לקבל מספיק אות פלואורסצנטי ללא רוויה בפיקסלים. בדרך כלל, עוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית בטווח של 5% עד 20% פועלת בצורה הטובה ביותר כדי למזער את ההלבנה.

התמקד בכל כנף האישון בהגדלה נמוכה או התמקד בפצע בהגדלה גבוהה כדי לחקור תיקון פצע. כדי ללכוד גם את האפיתל המתקן וגם את גיוס התאים הדלקתיים, ראשית, הגדר את המיקרוסקופ להקליט מחסנית z באמצעות התאמת המיקוד העדין בלוח הבקרה. סרקו מהאפיתל הפצוע ועד לחלל החוץ-תאי שמתחתיו, המכיל המוציטים נודדים.

לאחר מכן, הגדר את התוכנה להקליט פרוסות z דרך כנף האישון כל 3 מיקרון או במרווחים הדוקים עוד יותר. להדמיית זמן-lapse, הקלט ערימות z לפחות כל 30 שניות למשך שעה אחת לפחות.

בעת שימוש בבדיקות הניתנות להמרה כדי להמיר תמונות באופן סלקטיבי ולתייג תת-קבוצה של תאים במהלך ההדמיה, פתח את המודולים המתאימים בתוך תוכנת ההדמיה כדי לבצע את המרת הצילום ולהפעיל את הלייזר של 405 ננומטר. לאחר מכן, בחר את התאים להמרת תמונות בתוך תוכנת FRAP באמצעות כלי בחירה.

לאחר מכן, הגדר את מסלול הזמן להמרת תמונות למסגרת איטרציה אחת, והגדר את הלייזר של 405 ננומטר ל-20% עוצמת לייזר, ולאחר מכן לחץ על התחל את הניסוי כדי לבצע המרת תמונות. לאחר השלמתו, צא ממודול FRAP וחזור למסך ההדמיה המקורי. שם, כוונו את הלייזרים לפלואורופורים הנמצאים בשימוש ודמו את התאים שהומרו באור ולא הומרו באמצעות הקלטות זמן-lapse.