בדיקת היצמדות אופסונו-להערכת האופסוניזציה של חיידקים עטופים על ידי נוגדנים נגד קפסולות

קחו למשל תרחיף של Bacillus anthracis שנהרג כימית, עם תווית פלואורסצנטית.

קפסולת החיידקים, המורכבת בעיקר מחומצה פולי-גמא-גלוטמית, מספקת הגנה מפני פגוציטוזיס.

קח סרה פרימטים לא אנושיים, מושבתת בחום כדי להשמיד חלבונים משלימים. סרות אלה, שבודדו מבעלי חיים שחוסנו בחיסון המבוסס על קפסולת חיידקים, מכילות נוגדנים נגד קפסולות.

הוסף את תרחיף החיידקים שנהרג כימית לסרה. הנוגדנים נקשרים במיוחד לקפסולות החיידקים, מה שמקל על אופסוניזציה של חיידקים ומסמן אותם לחיסול על ידי תאים פגוציטים. הוסף חלבוני השלמה סטנדרטיים כדי לשפר את האופסוניזציה.

העבירו את החיידקים האופסונים למקרופאגים דבוקים - תאים פגוציטים. דגירה קצרה.

הנוגדנים והחלבונים המשלימים על החיידקים נקשרים לקולטני Fc מקרופאגים ולקולטני השלמה, בהתאמה, ומקדמים היצמדות חיידקים.

הסר מדיה. יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר חיידקים שאינם נדבקים.

תקן את התאים כדי לשמור על שלמות התאים.

השתמש בכתם פלואורסצנטי כדי לתייג את המקרופאגים.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, התבונן בחיידקים פלואורסצנטיים הנצמדים למקרופאגים פלואורסצנטיים שונים, המאשרים אופסוניזציה חיידקית יעילה על ידי נוגדנים נגד קפסולות.

שטפו את מלאי החיידקים המומת שלוש פעמים ב-PBS כדי להסיר קיבוע. הוסף תמיסת FITC בריכוז סופי של 75 מיקרוגרם למיליליטר. מערבבים לאט את התערובת במשך 18 עד 24 שעות בחום של ארבע מעלות צלזיוס. שטפו את החיידקים כמו קודם כדי להסיר עודפי FITC.

לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את הבצילים ב-PBS באותו נפח התחלה. אליקוט ואחסן בצילי ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. השבתת חום של נפח קטן של נסיוב בדיקה מפרימטים לא אנושיים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, בבלוק חום או במכונת PCR. הפשירו ושטפו חיידקים המסומנים ב-FITC עם PBS פעמיים על ידי כדורים ב-15,000 פעמים גרם למשך שלוש עד חמש דקות. השעיה ב-PBS באותו נפח התחלה.

בצלחת תחתונה עגולה של 96 בארות, יש לדלל באופן סדרתי את נסיוב הבדיקה במדיום התא. בצלחת תחתונה עגולה נוספת של 96 בארות, הוסף 10 מיקרוליטר של נסיוב בדיקה מדולל לכל באר. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של תוסף ארנב תינוק טרי.

לצלחת מספר שלוש, הוסף את הנפח המתאים של בצילים המסומנים ב-FITC עבור ריבוי זיהום של 20, למשל, בנפח המכיל 50,000 כפול 20 בצילים עבור 50,000 תאים. מלאו כל באר בלוח מספר שלוש בנפח המתאים של מדיום התא עד לסך של 105 מיקרוליטר. דגרו על צלחת מספר שלוש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בנוכחות 5% CO2 עם לחות כדי לעודד חיידקים.

הנח צלחת מספר אחת המכילה תאים דבקים על גוש חום של 37 מעלות צלזיוס. השתמש בצנרת רב-ערוצית כדי להסיר מדיום משומש מבארות והחלף במהירות ב-100 מיקרוליטר של חיידקים אופסוניים מלוח מספר שלוש כדי להבטיח שלא ייווצרו בועות בבארות במהלך הצנרת. כדי לא להפריע לשכבת התא החד-שכבתית, הוסף נפח לדפנות הבארות.

דגירה על צלחת מספר אחת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ ולחות למשך 30 דקות להדבקה. שטפו כל באר חמש פעמים עם 150 מיקרוליטר PBS על גבי גוש חום של 37 מעלות צלזיוס כדי להסיר חיידקים לא מחוברים. פיפטה לצד הבארות כדי להבטיח שהתאים לא יתפזרו בטעות במהלך הכביסה. הוסף 150 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד לכל באר, ותקן את התאים למשך שעה.

לאחר שטיפת התאים פעמיים עם PBS, מערבבים שני מיקרוליטרים של כתם תאים כתומים בעל תכולה גבוהה ב -10 מיליליטר PBS. לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטר מתמיסת הצביעה הזו לתאים קבועים, ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה. הניחו את לוחית מספר אחת על הבמה והתמקדו בתאים באמצעות שדה בהיר או ניגודיות פאזה.

בכרטיסייה רכישה, בחר פורמט 96-Well כהגדרת הלוחית ולאחר מכן בחר הגדרות ערוץ. לאחר מכן, בחר הגדרה למצב אריחים. ציין את מספר התמונות שיש לרכוש. שנה את מצב הרכישה לשחור-לבן או מונוכרום, והגדר את ה-binning ל-2 על 2 לפחות. הפעל את המיקוד האוטומטי או מודול המיקוד. ציין באיזו תדירות יש לבצע את פונקציית המיקוד האוטומטי.

לאחר מכן, הפעל את פונקציית z-stack אם היא זמינה, ציין את מספר ערימות ה-z שיתפסו את עובי התא החד-שכבתי והחיידקים הדבקים. הקצה תיקיית קבצים לשמירת התמונות. כעת, הפעל את תוכנית ההדמיה האוטומטית. בצע איסוף וניתוח נתונים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.