שיטת לוקליזציה של In Vivo Immunofluorescence לחקר הפצה ביולוגית של נוגדנים

קחו מודל עכברי של סרטן השד. גידולי בלוטת החלב מורכבים מתאי סרטן, פיברובלסטים הקשורים לסרטן, אדיפוציטים, תאי חיסון וכלי דם גידוליים.

הזרקה תוך ורידית של נוגדנים ספציפיים לגידול מצומד פלואורופור.

עם הגעתם לכלי הדם של הגידול, הנוגדנים נקשרים לחלבונים טרנסממברניים ספציפיים לגידול באנדותל כלי הדם ובתאי סרטן סמוכים.

יש לבודד בניתוח את בלוטת החלב ולהטביע אותה במדיום הקפאה.

השג חתכי קריו על שקופית ושטוף עם מאגר כדי להסיר את מדיום ההקפאה.

תקן את החלקים כדי לשמר את ארכיטקטורת הרקמות. מרחו חומר ניקוי לשיפור צביעה חיסונית ותמיסת חסימה למניעת קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

הציגו נוגדן ראשוני ספציפי למולקולות הידבקות על האנדותל של כלי הדם, ונוגדנים משניים מצומדים פלואורופור שנקשרים לנוגדנים הראשוניים, ומסמנים את כלי הדם.

הוסף אמצעי הרכבה על המגלשה והנח כיסוי.

תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, הערך את ההתפלגות הביולוגית של נוגדנים ספציפיים לגידול בתוך ומסביב לכלי הדם של הגידול המסומן פלואורסצנטי.

לאחר ההרדמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, התכוננו לחיסון וריד הזנב של תמיסות הנוגדנים. יש לחטא את זנב החיה על ידי ניגוב שלוש פעמים במגבון אלכוהול. הרחב את ורידי הזנב על ידי חימום עם כרית חום למשך כ-30 שניות; הימנע מחימום החיה כולה. בעזרת קטטר שבשבת זנב בגודל 27 הכנס את מחט הפרפר לאחד משני ורידי הזנב הצדדיים.

דמיין זרימת דם חוזרת לתוך הצנתר כדי להבטיח שהמחט ממוקמת כראוי כך שהתמיסות ייכנסו במלואן לבעל החיים במקום להילכד בזנב.

השתמש בפיסת סרט כירורגי כדי לקבע בזהירות את הזנב עם המחט המוחדרת לבמה. שטפו את הקטטר ב-25 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט. לאחר מכן, הזרקו את תמיסת הנוגדנים לקטטר באמצעות מזרקי אינסולין. שטוף את הקטטר שוב עם 25 מיקרוליטר PBS סטרילי. הסר את המחט מהזנב, והפעל לחץ כדי לעצור כל דימום.

בצע המתת חסד אנושית של העכבר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, והניח את העכבר במצב שכיבה. השתמש במספריים ומלקחיים כירורגיים כדי לכרות רקמות גידול. השתמש במלקחיים כדי לתפוס רק את שכבת העור החיצונית בין קבוצת בלוטות החלב הקרובות ביותר לזנב, וכדי לבצע חתך קטן עם מספריים כירורגיים. הכניסו את המספריים הסגורים לחיתוך, ופתחו לאט את הקצה כדי להפריד בזהירות את העור מקרום דופן הבטן הבסיסי, תוך שמירה על שלמותו.

בצע חתך אנכי במעלה הבטן, והמשיך להפריד את העור מהקרום הפנימי. בין בלוטות החלב השלישית והרביעית, בצע חתך אופקי על פני הבטן, כדי לאפשר נסיגה של העור והדמיה של בלוטות החלב. אוחזים בכל גידול או בלוטה רגילה בעזרת מלקחיים, חותכים בזהירות את העור המחובר באמצעות מספריים כירורגיים.

הנח רקמות שנכרתו בתבניות בסיס חד פעמיות לרקמות המסומנות מראש וממולאות במדיום הטמעה בטמפרטורת חיתוך אופטימלית. הקפיאו במהירות את התבניות על ידי הנחתם על קרח יבש. על מנת לחקור אספקה מחוץ למטרה, יש להוציא רקמות או איברים מעניינים אחרים. בעזרת קריוסטט, חתכו גושי רקמה קפואים בעובי של 10 מיקרון, והניחו חלקים סמוכים על שקופיות זכוכית הדבקה עם תווית מראש.

שטפו את שקופיות הרקמות הקפואות עם PBS בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי להסיר את המדיום המוטמע. תוחם קטעי רקמה בעזרת עט מחסום הידרופובי כדי להפחית את נפח התמיסות הדרושות במהלך הצביעה. תקן את חלקי הרקמה בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 5 דקות. לאחר שטיפת השקופיות ב-PBS למשך 5 דקות, יש לחלחל לחלקי רקמות עם 0.5% Triton X-100 ב-PBS למשך 15 דקות. שוטפים שוב את השקופיות ב- PBS למשך 5 דקות.

חסום את הרקמות עם PBS המכיל 3% משקל לנפח סרום בקר אלבומין ו-5% נפח לנפח סרום עיזים למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת השקופיות ב-PBS למשך 5 דקות, דגרו על החלקים עם נוגדנים ראשוניים לשמירת רשומות, כגון סמן גרעיני, כלי דם או ציטופלזמי נפוץ. כאן, נעשה שימוש ב-CD31 נגד עכבר חולדה בדילול של 1 עד 100 בתמיסת החסימה. המגלשות עם הנוגדן הראשוני נותרות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, מוגנות מפני התייבשות על מגש שקופיות.

לאחר הדגירה יש לשטוף את השקופיות ב-PBS למשך 5 דקות שלוש פעמים. שנה את ה-PBS בכל פעם. דגרו על השקופיות עם נוגדנים משניים כדי לסמן את הנוגדנים העיקריים. עבור יישום זה, דמיין נוגדן נגד B7-H3 באמצעות נוגדן נגד ארנב מצומד AlexaFluor-546, ודמיין CD31 עם נוגדן משני נגד חולדות עזים AlexaFluor-488 בתמיסת חסימה. הגן על המגלשות מפני אור והתייבשות על מגש שקופיות למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר שטיפת השקופיות ב-PBS, כמו קודם, יש למרוח טיפה אחת של מדיום ההרכבה במרכז פרוסת הרקמה. הנח בזהירות כיסוי הימנע מלכידת בועות אוויר. אוטמים את שולי הכיסוי עם לק שקוף ומניחים להתייבש. המשך בהדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה כמותית, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.