מולטיפלקס מבוסס חרוזים לזיהוי נוגדנים ספציפיים לפתוגן ברוק

קחו תערובת של קבוצות שונות של מיקרוספירות - או חרוזי פוליסטירן בגודל מיקרון.

כל קבוצה מחוברת לאנטיגן ייחודי מפתוגן סביבתי ומסומנת באופן פלואורסצנטי ייחודי.

מוסיפים את התערובת לצלחת סינון המכילה קרום בתחתית.

הכנס רוק אנושי המכיל נוגדנים נגד פתוגנים סביבתיים, הנקשרים לאנטיגנים קוגניטים במיקרוספרות.

הסר נוגדנים לא קשורים בוואקום. נוגדנים הקשורים למיקרוספירה נשמרים בשל גודל הנקבוביות הקטן של הממברנה.

הוסף נוגדנים משניים ביוטיניליים כדי להיקשר לנוגדנים הקשורים למיקרוספרה. הסר נוגדנים לא קשורים.

הוסף סטרפטווידין מצומד לצבע מדווח פלואורסצנטי, שנקשר לביוטין על הנוגדנים המשניים.

הסר את הצבע הלא קשור, השהה מחדש את המיקרוספירות והעביר אותן דרך מנתח אימונו-מולטיפלקס.

קרן לייזר מזהה את הקרינה של המיקרוספרה, ומזהה את האנטיגן, בעוד קרן אחרת מזהה את אות המדווח, ומאשרת נוגדן קשור.

נוגדנים ספציפיים לאנטיגן ברוק מצביעים על חשיפה קודמת לפתוגנים המתאימים.

לאחר השעיית מלאי החרוזים המצומדים לאנטיגן על ידי מערבולת וסוניקציה למשך 20 שניות, יש לדלל את מלאי החרוזים המצומדים לריכוז סופי של 100 חרוזים למיקרוליטר מכל ערכת חרוזים ייחודית ב-PBS בתוספת BSA. לאחר מכן, הכינו דילול של 1 עד 4 של רוק בטמפרטורת החדר ב- PBS בתוספת BSA בצלחת באר עמוקה של 96 בארות. הרטיבו מראש צלחת סינון עם 100 מיקרוליטר מאגר כביסה, ושאבו את הסופרנטנט.

לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של חרוזים מצומדים לאנטיגן ונפח שווה של הרוק המדולל ל-95 בארות של לוחית הסינון של 96 בארות לדילול סופי של אחד עד שמונה. במקביל, הוסף לבאר הבקרה 50 מיקרוליטר של חרוזים מצומדים לאנטיגן בתוספת 50 מיקרוליטר PBS בתוספת BSA בלבד.

דגרו את החרוזים בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה על שייקר המיקרופלייט ב -500 סל"ד. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט ושטפו את הבארות פעמיים עם 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה. לאחר הכביסה השנייה, השעו מחדש את החרוזים ב -50 מיקרוליטר PBS בתוספת BSA, דללו את הנוגדן המשני והוסיפו 50 מיקרוליטר ממנו לכל באר.

לאחר ערבוב תכולת הבאר עם פיפטה רב ערוצית, דגרו את הצלחת על השייקר בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הבארות פעמיים עם 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה, והשעו מחדש את החרוזים ב-50 מיקרוליטר PBS טרי בתוספת BSA.

כעת, יש לדלל את הכתב ולהוסיף 50 מיקרוליטר לכל באר. מערבבים היטב עם הפיפטה הרב-ערוצית. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר על השייקר בחושך, יש לשטוף את הבארות פעמיים כפי שהודגם. לאחר מכן, השעו מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של PBS בתוספת BSA, והעריכו את הדגימות על המנתח.