מדידה ציטומטרית של זרימה כמותית של פגוציטוזה של נבגים פטרייתיים על ידי פגוציטים אנושיים

קח צלחת מרובת בארות המכילה מתלה לויקוציטים אנושיים. הוסף נבגי פטריות פתוגניים המסומנים ב-FITC.

במהלך הדגירה, הנבגים מתנפחים ושוברים את שכבת החלבון ההידרופובית הנוקשה שלהם, וחושפים את הפוליסכרידים של דופן התא המזוהים על ידי קולטנים ספציפיים לזיהוי דפוסים על תאים פגוציטים.

קשירה זו מפעילה מסלולי איתות תוך-תאיים, מה שמוביל לסידור מחדש של אקטין ולהפנמת נבגים בתוך פגוזומים.

בהתאם למצב ההפעלה של פגוציטים, חלק מהנבגים נשארים דבוקים לתאים ללא הפנמה.

לאחר הדגירה, קצרו את התאים והעבירו אותם לצינור טרי.

צנטריפוגה. השעו מחדש את התאים במאגר והעבירו אותם לצלחת תחתונה V מרובת בארות.

הציגו נוגדנים נגד FITC המסומנים בפלואורופור הנקשרים למולקולות ה-FITC החשופות על נבגים נדבקים, ומכתימים אותם.

צנטריפוגה. השעו מחדש את התאים במאגר והעבירו אותם לצינורות ציטומטר זרימה.

בצע ציטומטריית זרימה כדי להבדיל בין נבגים מופנמים לדבוקים לתאים.

פגוציטים המכילים נבגים מופנמים מציגים אותות FITC, בעוד שתאים עם נבגים דבקים מציגים אותות FITC וכתמים נגדיים.

כדי להתחיל, העבירו 2 מיליון לויקוציטים ו-4 מיליון קונידיות עם תווית FITC ב-1.5 מיליליטר RPMI בתוספת 10% FCS לצלחת תרבית של 12 בארות. כלול בקרה על תאים בלבד ללא קונידיה ובקרה על תאים עם קונידיה ללא תווית. דגרו את הצלחת בחממת פחמן דו חמצני לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיו