בדיקת אימונופלואורסנציה לאפיון וכימות גרגרי עקה של יונקים

קח צלחת מרובת בארות המכילה תאי אוסטאוסרקומה דבקים על כיסויים.

תאי סרטן העצם הללו מטופלים מראש בכימיקל מעורר מתח, וכתוצאה מכך נוצרים גרגירי לחץ.

גרגירי מתח הם אברונים חסרי ממברנה ציטופלזמית הכוללים mRNA שאינם מתרגמים, תת-יחידות ריבוזומליות קטנות, חלבונים קושרי RNA או RBPs, גורמים הקשורים לתרגום וחלבוני איתות.

השלך את המדיה ושטוף את התאים עם מאגר. תקן את התאים כדי לשמר את המורפולוגיה התאית.

לחדור לתאים כדי לגשת למטרות תוך-תאיות. הוסף חלבונים חוסמים כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

הציגו נוגדנים ראשוניים הנקשרים ל-RBPs ספציפיים ולגורמים הקשורים לתרגום בתוך גרגירי הלחץ.

דגירה עם נוגדנים משניים שונים המסומנים בפלואורופור וצבע הוכסט.

נוגדנים משניים נקשרים לנוגדנים ראשוניים הקשורים לחלבונים הקשורים לגרגירי הלחץ, בעוד שמולקולות הוכסט צובעות את ה-DNA.

התקן את הכיסויים המכילים תאים באמצעות אמצעי הרכבה.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, התבונן בתאים כדי לדמיין ולכמת גרגירי לחץ, המופיעים כמוקדים פלואורסצנטיים המאופיינים בלוקליזציה משותפת של חלבונים קשורים.

כדי לתקן את התאים, הסר את המדיה מהבארות ושטוף את התאים בכ -250 מיקרוליטר PBS. הוסף כ-250 מיקרוליטר של תמיסת פרפורמלדהיד 4% חוצצת כדי לתקן את התאים, וודא שהחלק העליון של הכיסוי מכוסה לחלוטין. לאחר מכן, השאירו את הצלחת על נדנדה ספסל בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, הסר והשליך כראוי את הפרפורמלדהיד.

הוסף כ -250 מיקרוליטר מתנול קר כקרח כדי לחלחל ולשטח את התאים. דגרו את הצלחת למשך 5 דקות נוספות בטמפרטורת החדר על נדנדה. לאחר השלמת החדירה, השליכו את המתנול וחסמו את התאים על ידי מריחת כ-250 מיקרוליטר של מאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הנוגדנים העיקרית על ידי הוספת 12 מיקרוליטר של הנוגדנים כנגד G3BP1, eIF4G ו-eIF3b ל-3 מיליליטר של מאגר חוסם.

הוסף 250 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים לכל באר של צלחת 24 הבארות. דגרו את הצלחת על נדנדה למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר שעה של דגירה, הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף את התאים בכ-250 מיקרוליטר PBS למשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסף 12 מיקרוליטר של נוגדנים Cy2 נגד עכברים, Cy3 נגד ארנב ואנטי עזים Cy5 יחד עם 3 מיקרוליטר של צבע Hoechst ל-3 מיליליטר של מאגר חוסם כדי להכין את תמיסת הנוגדנים המשנית.

הוסף 250 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים המשנית לכל באר, וכסה את הצלחת כדי להגן על הדגימות מפני אור. דגרו את הצלחת על נדנדה בטמפרטורת החדר למשך שעה. בסיום הדגירה, הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף את התאים עם PBS למשך 5 דקות. מחממים מדיום הרכבה בבלוק החום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להפחית את הצמיגות. לאחר מכן, בעזרת קצה פיפטה חתוך מראש של 200 מיקרוליטר, הנח 25 מיקרוליטר ממדיום ההרכבה על שקופית זכוכית מסומנת.

בעזרת מלקחיים עדינים, העבירו את הכיסוי מהבאר לשקופית, והפכו את החלק העליון כך שהתאים פונים למדיום ההרכבה. השתמש בקצה P200 נקי כדי ללחוץ על הכיסוי כלפי מטה. לאחר הרכבת כל החלקות הכיסוי, הסר את אמצעי ההרכבה העודף על ידי לחיצה חזקה על רקמת מעבדה על המגלשה. לאחר מכן, שטפו את המגלשה במים, ומיד נגבו אותה שוב ברקמת מעבדה.