בדיקת אימונופלואורסנציה לאפיון וכימות גרגרי עקה של יונקים

קח צלחת מרובת בארות המכילה תאי אוסטאוסרקומה דבקים על כיסויים.

תאי סרטן העצם הללו מטופלים מראש בכימיקל מעורר מתח, וכתוצאה מכך נוצרים גרגירי לחץ.

גרגירי מתח הם אברונים חסרי ממברנה ציטופלזמית הכוללים mRNA שאינם מתרגמים, תת-יחידות ריבוזומליות קטנות, חלבונים קושרי RNA או RBPs, גורמים הקשורים לתרגום וחלבוני איתות.

השלך את המדיה ושטוף את התאים עם מאגר. תקן את התאים כדי לשמר את המורפולוגיה התאית.

לחדור לתאים כדי לגשת למטרות תוך-תאיות. הוסף חלבונים חוסמים כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

הציגו נוגדנים ראשוניים הנקשרים ל-RBPs ספציפיים ולגורמים הקשורים לתרגום בתוך גרגירי הלחץ.

דגירה עם נוגדנים משניים שונים המסומנים בפלואורופור וצבע הוכסט.

נוגדנים משניים נקשרים לנוגדנים ראשוניים הקשורים לחלבונים הקשורים לגרגירי הלחץ, בעוד שמולקולות הוכסט צובעות את ה-DNA.

התקן את הכיסויים המכילים תאים באמצעות אמצעי הרכבה.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, התבונן בתאים כדי לדמיין ולכמת גרגירי לחץ, המופיעים כמוקדים פלואורסצנטיים המאופיינים בלוקליזציה משותפת של חלבונים קשורים.

כדי לתקן את התאים, הסר את המדיה מהבארות ושטוף את התאים בכ -250 מיקרוליטר PBS. הוסף כ-250 מיקרוליטר של תמיסת פרפורמלדהיד 4% חוצצת כדי לתקן את התאים, וודא שהחלק העליון של הכיסוי מכוסה לחלוטין. לאחר מכן, השאירו את הצלחת על נדנדה ספסל בטמפרטורת