בדיקת מחשוף פפטיד פלואורוגני לבדיקת הפעילות הפרוטאוליטית של פרוטאזות

נגיפים עטופים עם חלבוני ספייק טרנסממברניים מכילים אתר מחשוף פרוטאוליטי.

פרוטאזות קשורות לממברנה על תאי המארח מבקעות את חלבוני הספייק, וחושפות פפטידי היתוך המאפשרים כניסת נגיף.

כדי להתחיל, קחו פפטידים מסוג בר עם אתר המחשוף הקנוני ופפטידים שונים, שכל אחד מהם נושא מוטציה ייחודית באתר.

הפפטידים הפלואורוגניים מכילים פלואורופור ומרווה. בשל הקרבה, המרווה סופג את הקרינה של הפלואורופור.

קח צלחת מרובת בארות על קרח, המכילה מאגר בדיקה ופרוטאזות מארח.

הוסף את הפפטידים מסוג הבר והוריאנטים לבארות נפרדות. דגירה בטמפרטורה מתאימה לפעילות פרוטאז מיטבית.

הפרוטאז מבקע את הפפטידים, מפריד את המרווה מהפלואורופור ומאפשר את פליטת הקרינה שלו.

מדוד את השינוי באות הקרינה כדי לקבוע את קצב המחשוף הפרוטאוליטי.

שיעור גבוה יותר עבור הרצף מסוג הבר מצביע על פעילות פרוטאוליטית גבוהה יותר, בעוד ששיעור נמוך יותר עבור הווריאנטים מעיד על יעילות מחשוף שונה.

הכן את מאגרי הבדיקה המתאימים לפרוטאזות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, וצנן את המאגרים על קרח. הניחו צלחת פוליסטירן שחור מוצק עם תחתית שטוחה של 96 בארות על קרח עם לוחית מתכת דקה מתחתיה כדי לתמוך בקירור ויציבות.

חיוני להשתמש בצלחת שחורה כלוחית הבדיקה כדי למנוע דליפת פלורסנט מבארות סמוכות.

לכל פפטיד, הכינו שלושה שכפולים טכניים לכל בדיקה בנפח כולל של 100 מיקרוליטר לדגימה. פיפטה את הכמות המתאימה של מאגר הבדיקה לכל באר של לוחית הבדיקה. הוסף 0.5 מיקרוליטר פרוטאז לכל באר. לשש בארות, הוסף 0.5 מיקרוליטר חיץ במקום הפרוטאז המתאים. שלושה מהם יהיו פקדים ריקים, ושלושת האחרים יהיו פקדי פפטידים.

הוסף 5 מיקרוליטר של הפפטיד לריכוז סופי של 50 מיקרומולר לכל באר, למעט הפקדים הריקים. לכל אחת משלוש בארות הבקרה הריקות, הוסף 5 מיקרוליטר של חיץ במקום פפטיד. הכנס את הלוח לקורא לוחות הקרינה ולחץ על התחל.