ניטור הגעתם של חלבוני שטח מתויגים GFP לרשת טרנס-גולג'י באמצעות ננו-גופים פונקציונליים
JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 5:00 דק' • July 8th, 2025
התחל עם תאי סרטן נטולי סולפט המבטאים חלבון פני שטח מתויג GFP.
הוסף סולפט עם תווית רדיו וננו-גופים אנטי-GFP מותאמים - נוגדן חד-שרשרת הנושא מוטיב טירוזין-סולפטציה, ודגירה.
תאים נטולי סולפט מפנימים סולפטים עם תווית רדיו, ומשלבים אותם ברכיבים תאיים.
הננו-גוף האנטי-GFP נקשר לחלבון פני השטח המתויג ב-GFP ועובר אנדוציטוז לשלפוחית. שלפוחית זו מעבירה את קומפלקס החלבון הננו-גוף לאורך מסלולים תוך-תאיים ספציפיים, כולל רשת טרנס-גולגי, או TGN.
בתוך ה-TGN, הסולפוטרנספראז בנוכחות מצע מעביר סולפט רדיואקטיבי לשאריות טירוזין ספציפיות על הננו-גוף, ובכך מסמן אותו רדיו.
שטפו את התאים. לאחר מכן, ליז את התאים.
צנטריפוגה את הליזאט כדי להסיר פסולת תאית גדולה. בודד את הננו-גופים בשיטת טיהור מבוססת חרוזי ניקל.
טען את השבר המבודד על ג'ל SDS-PAGE כדי להפריד את הננו-גוף המסומן ברדיו לרצועות נפרדות.
הכניסו את הג'ל לאוטורדיוגרפיה.
האוטו-רדיוגרף שהתקבל חושף אזורים חשוכים, המעידים על נוכחות הננו-גוף המסומן ברדיו.
במכסה המנוע של תרבית תאים, זרעו בין 400,000 ל-500,000 תאי HeLa המבטאים ביציבות חלבון מדווח מתויג GFP לצלחות 35 מ"מ או אשכולות של 6 בארות, עם מדיום שלם המכיל אנטיביוטיקה. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 7.5% פחמן דו חמצני למשך הלילה. למחרת, הסר את המדיום השלם, ושטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS בטמפרטורת החדר. הרעיבו את התאים במדיום נטול סולפט למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 7.5% פחמן דו חמצני.
בינתיים, במכסה מנוע או ספסל מאוורר המיועד לעבודה רדיואקטיבית, הכינו מדיום תיוג סולפט המכיל 0.5 מיליקורי למיליליטר נתרן גופרתי S35 במדיום נטול סולפט. לאחר מכן, מערבבים VHH כפול-שכבתי-סולף ב-1X PBS עם מדיום תיוג סולפט לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם למיליליטר. בסיום הדגירה, החלף את המדיה נטולת הסולפט ב-0.7 מיליליטר מתערובת המדיום המוכנה, המכילה נתרן גופרתי S35 ו-VHH דו-שכבתי-סולפי. דגרו את התאים למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני של 7.5%, המיועדת לעבודה עם רדיואקטיביות.
לאחר מכן, הסר את אמצעי התיוג ושטוף את התאים פעמיים-שלוש עם 1X PBS קר כקרח על צלחת קירור או על קרח. הוסף 1 מיליליטר של מאגר ליזה, בתוספת שני מילי-מולרי PMSF וקוקטייל מעכב פרוטאז 1X. דגרו על התאים למשך 10 עד 15 דקות על משטח נדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מגרדים ומעבירים את הליזאט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר, מערבלים את הליזאט ומניחים אותו על מסובב קצה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. צנטריפוגה במשקל 10,000 גרם וב -4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להכנת ליזאט פוסט גרעיני. העבירו את הליזאט הפוסט-גרעיני לתוך צינור של 1.5 מיליליטר המכיל חרוזי ניקל מוכנים, ודגרו על שייקר מקצה לקצה ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לבודד את הננו-גופים.
לאחר מכן, שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 1X PBS או מאגר ליזה על ידי כדורים עדינים ב-1000 גרם למשך דקה אחת. הסר בזהירות את כל מאגר הכביסה מהחרוזים, והוסף 50 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 2. מרתיחים בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר מכן, טען את החרוזים המבושלים על ג'ל מידי 12.5% SDS-PAGE, והפעל לפי פרוטוקול PAGE הסטנדרטי עד שצבע הייחוס הגיע לסוף הג'ל המפריד. תקן את ג'ל ההפרדה בכ -30 מיליליטר של מאגר קיבוע למשך שעה בטמפרטורת החדר. שטפו את הג'ל שלוש פעמים בכ-50 מיליליטר מים נטולי יונים, ולאחר מכן יבשו את הג'ל, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בסיום הייבוש, השתמש בהדמיית מסך זרחן כדי לצלם את הג'ל
.סקירה כללית
מחקר זה בוחן את ההפנמה (internalization) והסימון הרדיואקטיבי של חלבון פני השטח מתויג GFP בתאי סרטן במחסור לסולפטים. המתודולוגיה כוללת שימוש בננו-נוגדנים (nanobodies) אנטי-GFP משופרים למעקב אחר המסלולים התוך-תאיים והשינויים של החלבון.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- ביוכימיה
- מדעי המוח
רקע
- הבנת הפנימה של חלבונים היא קריטית עבור העברה של אותות תאיים.
- חלבונים המסומנים ב-GFP נמצאים בשימוש נרחב למעקב אחר תהליכים תאיים.
- סולפציה היא מודיפיקציה פוסט-טרנסלציונית משמעותית המשפיעה על תפקוד החלבון.
- תאי HeLa משמשים כמודל לחקר ביולוגיה של תאי סרטן.
מטרת המחקר
- לחקור את מנגנוני ספיגת הסולפט בתאי סרטן.
- לנתח את התעבורה התוך-תאית של חלבונים המסומנים ב-GFP.
- להעריך את יעילות הסימון הרדיואקטיבי במעקב אחר מודיפיקציות של חלבונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של תאי HeLa נטולי סולפט המבטאים חלבונים המסומנים ב-GFP.
- אינקובציה עם סולפט מסומן רדיואקטיבית ונוגדנים ננו-גופים (nanobodies) נגד GFP.
- בידוד של הנוגדנים הננו-גופים באמצעות טיהור מבוסס חרוזי ניקל.
- ניתוח של חלבונים מסומנים רדיואקטיבית באמצעות SDS-PAGE ואוטורדיוגרפיה.
תוצאות עיקריות
- הפנמה מוצלחת של סולפטים מסומנים רדיואקטיבית בתאי סרטן.
- זיהוי של מסלולים תוך-תאיים ספציפיים עבור קומפלקס הננו-בודי-חלבון.
- ויזואליזציה של ננו-בודיים מסומנים רדיואקטיבית באוטורדיוגרפים.
- הדגמה של מעקב יעיל אחר מודיפיקציה של חלבונים באמצעות סימון רדיואקטיבי.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי תעתוע חלבונים בתאי סרטן.
- סימון רדיואקטיבי הוא טכניקה בעלת ערך לחקר מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטות אלו כדי לבחון תהליכים תאיים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת מעקב מדויק אחר מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות ותעתוע תוך-תאי של חלבוני פני-שטח, ובכך תומכת בתיקוף מטרות (target validation) בתחומי הגילוי של תרופות לאונקולוגיה ולמדעי המוח. באמצעות כימות של שילוב סולפטים מסומנים רדיואקטיבית בקומפלקסים של נובודי-חלבון, היא מספקת תובנות מכניסטיות על נתיבי תעתוע רטרוגרדיים, החיוניים להערכת מעורבות המטרה (target engagement) ולהפחתת סיכונים בפיתוח ביולוגים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור אירועי מודיפיקציה של חלבונים לתוצאות תעתוק פונקציונליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי מעקב אחר הפנמה של חלבון פני שסומן ב-GFP והגעתו ל-TGN באמצעות נוגדנים ננו-פונקציונליים.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של שינויים בחלבון מסומן רדיואקטיבית במסלולי תעבורה בתאי חיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור זרימות עבודה המשך, באמצעות בידוד של נוגדנים ננו-גודליים (nanobodies) מסומני רדיו בעזרת טיהור באמצעות חרוזי ניקל.
- ערך תפעולי: תמיכה בסטנדרטיזציה של בדיקות ובשחזוריות באמצעות קריאות של SDS-PAGE כמותי ואוטורדיוגרפיה של שילוב סולפטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה באמצעות מידול ספיגת סולפט ותעתוע רטרוגרדי בתאי סרטן המבטאים חלבונים שטח המסומנים ב-GFP.
- ערך תפעולי: מתאר את הרציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי קישור של תעתוע נוגדנים ננומטריים (nanobodies) לפעילות סולפוטרנספראז ספציפית ל-TGN.
שילוב זרימת עבודה וקו עיבוד
ממקם את השיטה בשלב שבין הגילוי המוקדם לזיהוי המוליכים, ובכך תומך בבדיקת השערות הנוגעות לתעבורה של חלבונים על פני השטח ולמודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות במסלולי תיקוף המטרה.
- ביולוגיה של גילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת היפותזות על ידי מעקב אחר הגעת קומפלקס של ננו-נוגדן וחלבון פני שטח לרשת ה-trans-Golgi באמצעות זיהוי סימון רדיואקטיבי.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה באמצעות בידוד של ננו-נוגדנים מסומני רדיואקטיבית והפרדה ב-SDS-PAGE לצורך ניתוח כמותי של מודיפיקציות.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות של שילוב סולפט מסומן רדיואקטיבית, המאפשרות השוואה בין תנאי הובלה לבין יעילות המודיפיקציה.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרצף פרה-קליני על ידי מידול של הובלה רטרוגרדית במערכות של תאי סרטן הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה ככשרון בר-שימוש חוזר למעקב אחר מודיפיקציות של חלבונים במגוון מחלקות של מטרות ובקווי תאים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות תצפית ישירה על מודיפיקציה פוסט-טרנסלציונית במהלך תעתוע תוך-תאי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והדירות באמצעות טיהור בחרוזי ניקל וכמותן אוטורדיוגרפית של ננו-נוגדנים מסומנים רדיואקטיבית.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי תעתוק של חלבונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על נתוני מודיפיקציה כמותיים המעניקים ביטחון לגבי המעורבות של המטרה.
שיקולי יישום
- מומחיות מדעית נדרשת בטכניקות של סימון רדיואקטיבי, תרביות תאים וניקוי חלבונים.
- צורך במכשור ובתשתית אנליטית, כולל מדממי מסכי פוספור, צנטריפוגות ומערכות SDS-PAGE.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרוטוקולים של הרעבה לסולפטים, טיפול בסימון רדיואקטיבי וניקוי באמצעות חרוזי ניקל.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל, במיוחד עבור תנאים של חסר בסולפטים וביטוי של חלבונים על פני השטח המסומנים ב-GFP.
- מגבלות מעשיות כוללות תלות בפעילות הסולפוטרנספראז ברשת trans-Golgi ונגישות של שארירי טירוזין בננובודיס לצורך סימון רדיואקטיבי.
שאלות נפוצות בביופארמה
קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation
סרטונים קשורים
0 צפיות
עקיבה Neuroanatomical רטרוגרדית של הסרעפת מוטורי לגלוקוז בעכברים
סרטונים קשורים
0 צפיות
מבחר ננו-בודיות מעכבות ממוקדות טרנספורטר על-ידי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM)
סרטונים קשורים
0 צפיות
הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי
סרטונים קשורים
0 צפיות
בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G
סרטונים קשורים
0 צפיות
תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים
סרטונים קשורים
0 צפיות
שימוש בתג אתר איגוד α-bungarotoxin ללמוד GABA קולטן ממברנה לוקליזציה וסחר
סרטונים קשורים
0 צפיות
רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי
סרטונים קשורים
0 צפיות
באמצעות TMEM184A GFP-tagged לבנות לתעודה המעידה על הפרין קולטן זהות
סרטונים קשורים
0 צפיות
איתור של הפנמת קולטן מצמיד חלבון G-מופעל ליגנד ידי מיקרוסקופי Confocal
סרטונים קשורים
0 צפיות
עודכן לאחרונה: 29 אוגוסט 2026