בדיקה לכימות פגוציטוזה בתיווך נוגדנים של אריתרוציטים נגועים בטפילים

קח אריתרוציטים נגועים בפלסמודיום פלציפרום. סמנו את הדנ"א של הטפיל בצבע פלואורסצנטי להדמיית טפילים.

דגרו על אריתרוציטים נגועים בטפילים אלה עם נסיוב מאנשים שנחשפו למלריה. תאים אלה מציגים אנטיגנים של טפילים על פני השטח שלהם, הנצמדים לנוגדני IgG אנושיים שנרכשו באופן טבעי בסרה, ומאפשרים תאים לפגוציטוזיס.

העבירו את האריתרוציטים הנגועים בטפיל האופסוני לצלחת מרובת בארות מצופה חלבון המכילה תרחיף של מונוציטים שמקורם בבני אדם - או תאים פגוציטים.

במהלך הדגירה, קולטני Fc-gamma על מונוציטים מקיימים אינטראקציה עם אריתרוציטים אופסוניים IgG, ומעוררים בליעה של אריתרוציטים לתוך פגוזומים.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצלחת כדי למנוע אינטראקציות תאיות נוספות ולעצור פגוציטוזיס.

השליכו את הסופרנטנט. לטפל בתמיסת אמוניום כלוריד, תוך קריעה סלקטיבית של אריתרוציטים נגועים שאינם פגוציטוזים מבלי להשפיע על מונוציטים.

הוסף מאגר המכיל סרום כדי לעצור את תהליך הליזינג. צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט המכיל אריתרוציטים ליזים.

השעו מחדש את המונוציטים במאגר.

בצע ציטומטריית זרימה כדי לכמת מונוציטים המציגים פלואורסצנטיות מהאריתרוציטים הנגועים בטפיל בתוכם, ומאשרים את הפגוציטוזיס המתווך נוגדנים שלהם.

התאם את תרחיף האריתרוציטים הנגוע המטוהר ב-3.3 פעמים 10 לתאים השביעיים למיליליטר במדיום תרבית טפילים המכיל אתידיום ברומיד לריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, הסר את תמיסת החסימה מצלחת אחת של 96 בארות על ידי הזזת הצלחת למיכל פסולת. לאחר מכן, הסר את כל העודפים מעל מגבת נייר, והוסף 30 מיקרוליטר של תרחיף אריתרוציטים נגוע בתווית אתידיום ברומיד לכל הבארות מלבד אחת בחצי העליון של הצלחת. הוסף 30 מיקרוליטר של מדיום תרבית טפילים לבאר הריקה, ודגר את הצלחת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.

בתום הדגירה מוסיפים 170 מיקרוליטר של מדיום תרבית טפילים לכל באר, ומשקעים את האריתרוציטים הנגועים בתחתית הצלחת על ידי צנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט על ידי הזזת הצלחת לתוך מיכל פסולת, ושטוף את האריתרוציטים הנגועים המסומנים באתידיום ברומיד פעמיים נוספות עם 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית טפילים לבאר, כפי שהודגם זה עתה.

לאחר השטיפה השנייה, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להסיר בזהירות את כל נפח הסופרנטנט מכל באר, מבלי להפריע לכדורים, ולהשעות מחדש את האריתרוציטים הנגועים המסומנים באתידיום ברומיד ב-30 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים, כולל הבקרות המתאימות ודגימות הבדיקה שהוכנו בעבר במדיום תרבית טפילים. לאחר מכן, הניחו את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות, מוגנת מפני אור.

בזמן שהאריתרוציטים הנגועים עוברים אופסוניזציה, אספו את תאי ה-THP-1 על ידי צנטריפוגה, והשעו את הגלולה ב-12 מיליליטר של מדיום תרבית תאי THP-1 טרי שחומם מראש.

לאחר צנטריפוגה שנייה, השעו מחדש את הגלולה ב-1 מיליליטר של מדיום תרבית תאים THP-1 לספירה, והתאימו את ריכוז התאים ל-5 כפול 10 לתאים ה-5 למיליליטר במדיום תרבית תאים THP-1. הסר את תמיסת החסימה מהצלחת השנייה של 96 בארות, והוסף 100 מיקרוליטר של תאי THP-1 לכל באר. לאחר מכן, הניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים.

בתום הדגירה של האופסוניזציה, הוסף 170 מיקרוליטר של מדיום תרבית טפילים לכל באר של צלחת האופסוניזציה, ושקע את האריתרוציטים הנגועים לתחתית הצלחת על ידי צנטריפוגה. שטפו את האריתרוציטים הנגועים והאופסוניים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית טפילים לבאר באמצעות פיפטה רב-ערוצית כדי להסיר בזהירות את הסופרנטנט לאחר הכביסה השנייה.

השעו מחדש את האריתרוציטים הנגועים האופסונים ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי THP-1 מחומם מראש לכל באר, והעבירו 50 מיקרוליטר מכל תרחיף אריתרוציטים נגוע ואופסוניים לבאר מתאימה בצלחת הפגוציטוזיס. לאחר הוספת כל התאים, הניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך לא יותר מ- 40 דקות, מוגנת מפני אור.

בתום הדגירה יש לעצור את הפגוציטוזה על ידי צנטריפוגה ב -4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט, והשהה מחדש את הכדורים עם 150 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום כלוריד בטמפרטורת החדר לכל באר. לאחר שלוש דקות בדיוק, הוסף 100 מיקרוליטר של 2% FBS קר כקרח ב-PBS כדי לעצור את הליזה, ולשקע את התאים השלמים על ידי צנטריפוגה.

לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר FBS טרי קר כקרח 2% ב-PBS, לבאר, לכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את גלולת התא ב -200 מיקרוליטר של 2% FBS טרי קר כקרח ב- PBS לבאר.

לצורך רכישה וניתוח של ציטומטריית זרימה, טען מיד את התאים על ציטומטר זרימה, והשתמש בתרשים פיזור צד ליניארי קדימה לעומת ליניארי עבור הבארות ללא אריתרוציטים נגועים כדי לשער את תאי THP-1. רכשו 10,000 אירועים בשער זה, והשתמשו בתאי THP-1 עם האריתרוציטים הנגועים עם בקרה חיובית כדי להגדיר תרשים היסטוגרמה למדידת עוצמת הקרינה של אתידיום ברומיד.

לצורך ניתוח, פתח את תרשים פיזור הצד הליניארי קדימה לעומת ליניארי עבור הבארות ללא אריתרוציטים נגועים, ושער את תאי THP-1. לאחר מכן, הגדר שער חיובי בהיסטוגרמה FL3, והעתק את השערים הללו לכל בארות הדגימה האחרות כדי לקבוע את אחוז תאי THP-1 חיוביים לאתידיום ברומיד.