בדיקת מבחנה למדידת פעילות פרוטאז סרין נויטרופיל באמצעות כתב פלואורסצנטי

יש ליטול מיקרו-פלטה המכילה נויטרופילים סרין, פרוטאזות או NSPs. אנזימים מסיסים אלה בעלי פעילות פרוטאוליטית, המופרשים על ידי נויטרופילים, מתפקדים בתגובות דלקתיות.

הוסף בדיקות דיווח פלואורסצנטיות הנושאות מוטיב זיהוי המשמש כאתר מחשוף עבור NSPs. הבדיקות מצומדות לתורם ולפלואורופור מקבל.

עם עירור באורך גל מסוים, הפלואורופור התורם פולט אנרגיה. בשל קרבתו לתורם, הפלואורופור המקבל סופג את האנרגיה ופולט פלואורסצנטיות באורך גל שונה.

זהה את אותות התורם והמקבל בנפרד וחשב את היחס בין תורם למקבל כדי להעריך את פעילות ה-NSP. יחס נמוך מעיד על כיבוי הקרינה של התורם בהיעדר מחשוף בדיקה.

ה-NSPs מזהים וחותכים את מוטיב הזיהוי על הבדיקות, ומשחררים את המקבל.

המרחק מהמקבל מאפשר פליטת פלואורסצנטיות מהפלואורופור התורם, ומגדיל את היחס בין התורם למקבל. יחס גבוה מצביע על מחשוף בדיקה יעיל על ידי ה-NSPs.

להפשיר אנזימים על קרח, ולהגדיר עקומה סטנדרטית של אנזים כמתואר בכתב היד הטקסטואלי. במקביל לתכשיר הסטנדרטי, יש לדלל דגימות ליחה במאגר ההפעלה. בקורא הצלחות, הגדר את אורך גל העירור עבור בדיקת NE FRET NEmo-1 ל-354 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ל-400 ננומטר לתורם ו-490 ננומטר למקבל.

עבור בדיקת CG FRET sSAM, הגדר את אורך גל העירור ל-405 ננומטר, ואת הפליטה ל-485 ננומטר לתורם, ו-580 ננומטר למקבל. הוסף 40 מיקרוליטר של דגימות, תקנים או ריקים לבארות של צלחת חצי שטח שחורה של 96 בארות והוסף את תערובת המאסטר.

הפעל את קורא הצלחות, ורשום את העלייה ביחס התורם למקבל לאחר כל 60 עד 90 שניות למשך 20 דקות לפחות או עד שהעלייה באות מגיעה למישור. ייצא את הנתונים וחשב את יחס התורם למקבל על ידי חלוקת ה-RFU של התורם ב-RFU המקבל עבור כל נקודת זמן ודגימה. לאחר מכן, חשב את ממוצע היחס בין תורם למקבל וסטיית תקן. קבע את השיפוע בתוך הצמיחה הליניארית של שינוי היחס בין תורם למקבל.