בדיקת מבחנה לחקר ציטוטוקסיות של תאי T CD8⁺ מופעלים מראש נגד תאים סרטניים

קח שתי אוכלוסיות תאי CD8⁺ T: תאי CD8⁺ T אפקטורים המופעלים מראש באמצעות מעורבות בתיווך נוגדנים של תאי T וקולטנים לגירוי משותף ותאי CD8⁺ T מדוכאים המעוכבים על ידי תאים מדכאים שמקורם במיאלואיד.

הוסף תאי T אלה לבארות מצופות קרום מרתף עם תאים סרטניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי מוגבל גרעיני.

פיפטה, מצע קספאז-3 פלואורוגני - צבע פלואורוגני קושר DNA המצומד לפפטיד המכיל אתר זיהוי קספאז-3.

דגירה. קולטני תאי T אפקטורים נקשרים לקומפלקס פפטיד MHC מסוג I על תאי הסרטן, מה שגורם לשחרור גרגירים ציטוטוקסיים המכילים פרפורינים וגרנזימים.

פרפורינים יוצרים נקבוביות של קרום התא הסרטני, ומאפשרים כניסת גרנזים והפעלת קספאז, ויוזמים אפופטוזיס.

קספזות מופעלות מבקעות בנוסף את מצע הקספאז הפלואורוגני, ומשחררות את הצבע שנקשר ל-DNA ולפלואורסצות.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, תאים סרטניים שגודלו יחד עם תאי T אפקטורים מציגים פלואורסצנטיות גרעינית כפולה, מה שמעיד על אפופטוזיס של תאי סרטן.

לעומת זאת, תאים סרטניים שגודלו בתרבית משותפת עם תאי T מדוכאים מציגים רק פלואורסצנטיות של חלבון גרעיני, מה שמרמז על תאים שאינם אפופטוטיים.

כדי להקים תרבית משותפת של תאי מטרה חיוביים ל-CD8 המופעלת מראש, ראשית, הוסף 30 מיקרוליטר של 1 עד 100 מטריצת ממברנת בסיס מסיסה מופחתת עם גורם גדילה מדולל לבארות המתאימות של צלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות המתאימה למיקרוסקופיה. נענע את הצלחת כדי לפזר את המטריצה באופן שווה, והניח את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך שעה לפחות. בזמן שהצלחת מתאזנת, הכינו את תאי המטרה. שאפו את המדיום, שטפו עם PBS והוסיפו 1 מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA בטמפרטורת החדר למשך דקה.

הוסף 9 מיליליטר של DMEM בתוספת סרום בקר עוברי על ידי פיפטינג עדין, והעביר את התאים המנותקים לצינורות. לאחר צנטריפוגה של התאים, השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של EDMEM. סנן את התאים המורחפים דרך מסננת תאים וספור את התאים החיים. לאחר מכן, התאם את הצפיפות ל-4 כפול 10 לתאי המטרה הרביעיים למיליליטר ב-EDMEM טרי על קרח.

לאחר מכן, פיפטה את תאי ה-T החיוביים ל-CD8 שהופעלו מראש כמה פעמים כדי להשעות את התאים לתרחיף של תא בודד, ולהעביר את תאי ה-T הצפים לצינור אחד של 1.5 מיליליטר לכל מצב. אוספים את כל התאים שנותרו עם 200 מיקרוליטר PBS לבאר, מעבירים את השטיפות לצינורות המתאימים של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה. שאפו את המדיום, והוסיפו 1 מיליליטר של EDMEM לכל צינור לצנטריפוגה.

לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של EDMEM טרי לכל צינור. לאחר הספירה, התאימו את התאים בכל צינור לצפיפות של 1.6 כפול 10 לתאי T חיוביים ל-CD8 המופעלים מראש לכל מיליליטר תווך, והניחו את התאים על קרח. כאשר התאים מוכנים, שאפו את מטריצת קרום המרתף מכל באר של לוחית המיקרוסקופיה של 96 הבארות, והוסיפו 50 מיקרוליטר של תאי מטרה לבארות בודדות בתוך 60 הבארות הפנימיות של הצלחת עם ערבוב.

הוסף 25 מיקרוליטר של EDMEM בתוספת 4 כפול 10 ליחידות השלישיות למיליליטר של IL-2, ו-10 מצע פלואורוגני מיקרו-מולרי קספאז-3 לבארות המתאימות. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של תאי T חיוביים CD8 שהופעלו מראש לבארות המתאימות, ולבסוף, הוסף EDMEM לבארות המתאימות כדי ליצור נפח כולל של עד 100 מיקרוליטר. מוסיפים 200 מיקרוליטר PBS או מים סטריליים לכל הבארות הריקות, מנערים את הצלחת ומשאירים את הצלחת על משטח ישר למשך 10 דקות.

כדי לדמות את התאים, הגדר את המיקרוסקופ לרכישת תמונות בניגודיות פאזה, כמו גם תעלות פלואורסצנטיות המתאימות לחלבון הפלואורסצנטי המוגבל גרעיני, ופלואורופורי מצע קספאז-3 המופעלים פלואורוגניים המשמשים בניסוי. לאחר מכן, צלמו תמונות של כל באר ניסוי בניגודיות פאזה, ושל שני ערוצי הפלואורסצנט כל שעה עד שלוש שעות למשך 72 שעות לפחות.