בדיקת מיקרו-נטרול למדידת נוגדנים מנטרלים בסרום אנושי

לבדיקת מיקרו-נטרוליזציה, קח צלחת מרובת בארות המכילה סרום אנושי מדולל בחום עם ריכוזים פוחתים של נוגדנים מנטרלים ספציפיים לשפעת.

להציג נגיפי שפעת פתוגניים. נוגדנים בסרום מקיימים אינטראקציה עם הנגיפים ומנטרלים אותם; עם זאת, דילולים גבוהים יותר בסרום מציגים נטרול מוגבל של הנגיף.

זרע עם תאי כליה של Madine-Darby, או תאי MDCK, המבטאים יתר על המידה שאריות חומצה סיאלית אנושית על פני השטח שלהם.

בדילול הגבוה יותר, נגיפי שפעת לא מנוטרלים מתמזגים עם החומצה הסיאלית של התאים, ומשחררים את הגנום הנגיפי לציטופלזמה של התא.

הגנים הנגיפיים משועתקים ומתורגמים לחלבונים נגיפיים ונוקלאופרוטאינים בתוך התא המארח.

טפל בריכוז גבוה של אצטון לקיבוע וחדירה.

להציג נוגדנים ראשוניים המקיימים אינטראקציה עם נוקלאופרוטאינים נגיפיים.

שכבת נוגדנים משניים מצומדים לאנזים המקיימים אינטראקציה עם נוגדנים ראשוניים. שוטפים ומטפלים במצע האנזים, ומייצרים מוצר צבעוני.

כמת את עוצמות הצבע ושרטט אותן מול דילול הסרום; הדילול הגבוה ביותר בסרום, השגת חמישים אחוז נטרול הנגיף מייצג את טיטר הנטרול.

ביום הראשון של בדיקת MN, יש להפשיר את הסרום באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, ולהוציא מיד לאחר ההפשרה. השבת את הסרום האנושי למשך 30 דקות באמבט מים של 56 מעלות צלזיוס, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הניחו את הסרום על קרח, והוסיפו את מדלל הנגיף לסרום כדי להשיג דילול מקדים של 1 עד 10.

כדי לבדוק עם נגיף אחד, הוסף 50 מיקרוליטר של מדלל וירוס לשורות B עד H, למעט עמודות 11 ו-12. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של 1 מתוך 10 סרום מדולל לעמודות A1 עד A10. בצע דילול טורי כפול משורות A עד H, והשליך את 50 המיקרוליטרים האחרונים בשורה H.

לבקרת הנגיף, הוסף 50 מיקרוליטר של מדלל וירוס לבארות A12, B12, C12 ו-D12. לבקרת התאים, הוסף 100 מיקרוליטר של מדלל וירוסים לבארות E12, F12, G12 ו-H12. עבור סרה הבקרה, הוסף 100 מיקרוליטר של נסיוב בקרה מדולל לבאר A, עמודה 11, והוסף 50 מיקרוליטר של מדלל וירוסים לבארות B11 עד H11. המשך לדלל באופן סדרתי. מכסים את הצלחות ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, עד שהם מוכנים לתוספת הנגיף.

לתוספת וירוסים, יש לדלל את הנגיף ל-100 TCID50 ב-50 מיקרוליטר עם מדלל הנגיף. הוסף 50 מיקרוליטר של וירוס מדולל לכל הבארות, למעט עמודה 11 בלוחות הטיטרציה האחוריים, ובארות בקרת התאים E12, F12, G12 ו-H12 בכל הלוחות. הוסף 50 מיקרוליטר של מדלל וירוסים לכל הבארות בעמודה 11. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של הנגיף ב-100 TCID50 ב-50 מיקרוליטר לבאר הראשונה.

לאחר מכן, מערבבים ומעבירים 50 מיקרוליטר לבארות עוקבות כדי לבצע דילול סדרתי כפול. החלף את קצות הפיפטה בין הבארות כדי למנוע העברת וירוסים. השלך 50 מיקרוליטר מבאר H11, ולאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של מדלל וירוסים לעמודה 11 כדי להביא את הנפח הסופי ל-100 מיקרוליטר. הקש על הצלחות כדי לערבב. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך שעה אחת לפני ביצוע הוספת תאי MDCK ביום הראשון ו-ELISA ביום השני כמו קודם.

לאחר הוספת הנוגדנים הראשוניים והמשניים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, בצע הוספת מצע וקריאת צלחת. שטפו את הצלחות חמש פעמים עם 300 מיקרוליטר של מאגר כביסה והקישו על מגבון נטול מוך. הוסף 100 מיקרוליטר של מצע OPD טרי שהוכן לכל באר. לאחר מכן, דגרו על הלוחות בטמפרטורת החדר עד שבארות בקרת הנגיף יגיעו לצפיפות אופטית של 490 ננומטר בין 0.8 ל-3, כאשר בקרת התא ב-OD רקע נמוך פחות מ-0.2. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת העצירה לכל הבארות.

קרא את ה-OD של הבארות ב-490 ננומטר, באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-פלטה. לבסוף, קבע את טיטר הנוגדנים המנטרלים של כל דגימת סרום, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.