בדיקה לאיתור ייצור מיני חמצן תגובתי ברקמת אורז עם התעוררות חיסונית

קח מיקרופלייט המכיל מקטעי נדן אחידים שנחתכו משתילי אורז ודיסקיות עלים המתקבלות מעלי צמח האורז.

הוסיפו מים סטריליים ודגרו למשך הלילה כדי לאפשר התאוששות מלחץ הפצעים.

הוסף פפטיד אימונוגני שמקורו בדגל חיידקי הפועל כדפוס מולקולרי הקשור לפתוגן או PAMP.

תאי צמחים בקצוות החתוכים נקשרים ל-PAMPs באמצעות קולטנים לזיהוי תבניות.

הקישור מפעיל איתות במורד הזרם, ומפעיל אנזים מקומי בקרום פלזמה הנקרא הומולוג אוקסידאז פרץ נשימתי או RBOH.

RBOH מופעל מייצר מיני חמצן פעילים או ROS באפופלסט - החלל הבין-תאי. ה-ROS המיוצר מומר למי חמצן.

הוסף אנזים פרוקסידאז ומצע כימילומינסצנטי.

פרוקסידאז משתמש במי חמצן כדי להמיר את המצע למצב ביניים נרגש, המשחרר אנרגיה כאור וחוזר למצב הקרקע.

מדוד את הזוהר בשני סוגי הרקמות כדי לזהות עלייה חדה מיד לאחר הטיפול ב-PAMP, מה שמעיד על פרץ ROS.

חותכים את הנדן משתילי אורז בני 10 ימים למקטעים של 3 מילימטר בעזרת סכין גילוח חד או להב כירורגי לטיפול מקדים יום לפני בדיקת ה- ROS. מניחים 5 מקטעי נדן בבאר בודדת של צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות המכילה 100 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים למשך 10 עד 12 שעות.

חותכים את דיסקי העלים מצמחי אורז בני ארבעה עד שישה שבועות בעזרת אגרוף ביופסיה עם בוכנה. חתוך תמיד את דיסקי העלים מהשליש האמצעי של העלה השני של הטילר הראשי כדי להפחית את שונות הנתונים. לאחר מכן, הניחו דיסק עלה אחד בבאר בודדת של צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות המכילה 100 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים למשך 10 עד 12 שעות לטיפול מקדים. שמור את כל דיסקיות העלים צפות ופונות כלפי מעלה בבארות של צלחת מיקרוטיטר לטיפול מקדים במים כדי למנוע שונות הקשורה לצד העלה.

הכן תמיסת סילוק על ידי שילוב של 9.4 מ"ל של 50 מיקרו-מולרי tris-HCl, 400 מיקרוליטר של תמיסת L-012, 100 מיקרוליטר פרוקסידאז חזרת ו-100 מיקרוליטר של flg22. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת הסקה לבארות.

הפעל את התוכנה ולחץ על כפתור הניסויים כדי ליצור פרוטוקול חדש או להשתמש בפרוטוקול קיים. נקישה נוהל בחלון הקופץ כדי להגדיר את הצלחת ולבחור את הבארות מהצלחת שיש לנטר. לחץ על התחל קינטי והגדר את זמן הריצה ל- 30 דקות או יותר, בהתאם לדרישות הניסוי. בחר מרווח מינימלי כדי לקבל את הקריאות בתדירות גבוהה ככל האפשר, ועבור זמן האינטגרציה, בחר שנייה אחת או יותר, בהתאם לעוצמת האות.

לחץ על אימות ואחריו אישור כדי לאשר את ההגדרות. לאחר מכן לחץ על זהה לוחית חדשה בחלון הקופץ והמתן עד שהתוכנה תבקש את תיבת הדו-שיח של לוחית הטעינה. הסר בזהירות את המים המזוקקים הכפולים מהבארות המכילות את הרקמות שטופלו מראש, והימנע מכל נזק לרקמות או התייבשות. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 200 מיקרוליטר מתמיסת הגירוי לבארות המכילות את הרקמות. הנח את הצלחת לבדיקה על המנשא, והתחל בזיהוי.