מדידת אלורטיאקטיביות באוכלוסייה מעורבת של תאי T

התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה תאים דנדריטיים של עכברים, או DCs הנושאים אלואנטיגנים או וריאנטים גנטיים של אנטיגנים עצמיים.

הכנסת תאי T של עכברים, כולל תאי T אלוראקטיביים שאינם מגיבים לאנטיגנים עצמיים, תוך זיהוי אנטיגנים זרים.

תאי ה-T האלוראקטיביים מזהים את האלואנטיגנים הללו ומקיימים אינטראקציה עם DCs, מה שמפעיל סידור מחדש של שלד התא, כולל ארגון מחדש של F-actin.

זה מקדם קולטנים על תאי T לעסוק במולקולות מעוררות ב-DCs, ויוצרים חיבור תאי - סינפסה אימונולוגית.

תקן את התאים, העביר אותם לצינור והכנס קוקטייל של נוגדנים המסומנים בפלואורוכרום ספציפיים לקולטני תאי T ו-DC, המעניקים פלואורסצנטיות מובהקת.

הסר נוגדנים לא קשורים והשהה מחדש את התאים במאגר המכיל חומר חודר המחלחל לתאים וסמני חלבון ירוקים המתויגים בפלואורופור הנקשרים ל-F-אקטין.

צנטריפוגה ותשעה מחדש את התאים במאגר המכיל צבע גרעיני, ומכתים את הגרעינים באדום.

באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה, זהה את הכפילים - המתאימים לתאי T ומצומדים DC עם כוונת ירוקה של F-actin - המאשרים היווצרות סינפסות.

כמת את הכפילים המייצגים את מידת הפעילות.

התחל בזריעה של 0.5 פעמים 10 לתאים הדנדריטים השישיים לכל באר של צלחת תרבית תאים של 96 בארות, ואחריה 1 כפול 10 לתאי T השישיים בנפח סופי של עד 50 מיקרוליטר בסך הכל של מדיום תרבית לבאר. דגרו על התרביות הקרות במשך ארבע שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר מכן, הוסף פי שלושה מנפח התרבית של פורמלדהיד 1.5% ב-PBS לכל באר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הקיבוע, העבירו את התאים מכל באר לצינור פוליסטירן מתאים של 5 מיליליטר, וצבעו בתאים עם הנוגדנים המצומדים לפלואורוכרום המתאימים ב-100 מיקרוליטר של מאגר כביסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.

לאחר מכן, שטפו את התאים במיליליטר אחד של מאגר כביסה והשעו מחדש את הכדורים במאגר שטיפת סלסול המכיל פלואידין-FITC. לאחר 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור, שטפו את התאים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת סלסול טרי. השעו מחדש את הכדורים בצבע הגרעיני המעניין במאגר שטיפת סלסול למשך 30 דקות אחרונות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור, ושטפו את התאים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת סלסול, ולאחר מכן שטיפה אחת במאגר כביסה בלבד. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים ב-50 עד 100 מיקרוליטר של מאגר שטיפה טרי, והעבירו את התאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגות קטנים.

כדי לנתח את האינטראקציות בין תא לתא, ראשית, שמור ערוץ אחד לרכישת תמונת שדה בהיר, וטען את צינור הבקרה הראשון. כאשר ערוץ השדה הבהיר כבוי, בחלון סביבת עבודה, צור תרשים פיזור חדש עבור כל ערוץ המשמש עם יחס הגובה-רוחב על פני השטח, ושדר את הסינגלטים שבהם יחס הגובה-רוחב קרוב לאחד.

עבור כל פלואורוכרום, בדוק את האוכלוסייה החיובית, והתאם את מתח הלייזר בתיבת התאורה לפי הצורך. בתיבה ערוצים, בחר את הערוצים המתאימים לפלואורוכרומים המשמשים לצביעה. לאחר מכן, לחץ על הקלט. כאשר מספר האירועים יגיע לסף שצוין, הרכישה תיפסק באופן אוטומטי.

לאחר שכל בקרות הכתמים הבודדים נרכשו, טען את צינור הדגימה הניסיוני הראשון, ורכוש כמה עשרות אלפי אירועים תחת ערוצי הניתוח המתאימים, כולל ערוץ השדה הבהיר.