זיהוי וספירה של תאי מערכת החיסון בנוזל שטיפה סימפוני לפי ציטומטריית זרימה

התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה נוזל שטיפת סימפונות עכבר הכוללת אוכלוסיית תאים חיסוניים המוכתמת בצבע כדאיות פלואורסצנטי ירוק.

הכנסת נוגדנים ל-Fc כדי לחסום את קולטני ה-Fc של תאי החיסון.

הוסף קוקטייל של נוגדנים מובהקים המסומנים בפלואורופור המכוונים לסמני תאים ספציפיים. הסר נוגדנים לא קשורים והשהה מחדש את התאים במאגר.

באמצעות ציטומטריית זרימה, זהה סינגלים פלואורסצנטיים עמומים, המצביעים על תאים חיים.

מאיר תאים ב-488 ננומטר, וגורם לתאים לפלוט פלואורסצנטיות אדומה בקורלציה עם תאים המבטאים CD11c.

בתוך אוכלוסיית CD11c הגבוהה, עם מסנני אורך גל מתאימים, זהה חלבוני סמן תאים MHC-II על תאים דנדריטיים ו-SiglecF על מקרופאגים.

באוכלוסייה הנמוכה CD11c, ביטוי של CD3 על תאי T ו-CD19 על תאי B מאפשר את זיהויים.

מאיר תאים ב-405 ננומטר, פולט פלואורסצנטיות כחולה, המסמלת את הנויטרופילים המבטאים CD11b.

תאים מאירים ב-633 ננומטר מעוררים פלואורופורים אדומים רחוקים על אאוזינופילים המבטאים Ly-6G.

באמצעות נתוני זרימה ציטומטרית, ספרו את השפע של כל סוג של תא חיסוני בנוזל שטיפת הסימפונות.

לאחר איסוף שטיפת הסימפונות השלישית, יש לצנטריפוגה את השואב המאוחסן, ולאחסן את הסופרנטנט בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר ליזה ACK. לאחר לא יותר משתי דקות בטמפרטורת החדר, יש לדלל את מאגר הליזיס במיליליטר אחד של PBS קר ולאסוף את התאים באמצעות צנטריפוגה.

השעו מחדש את הגלולה בנפח המתאים של PBS למספר הדגימות שיש לנתח והעבירו את התאים למספר הבארות המתאים של צלחת של 96 בארות לניתוח. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה נוספת, והשהה מחדש את הכדורים ב-50 מיקרוליטר של בלוק FC ב-PBS.

לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו 50 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים המתאים המעניין לכל באר, ודגרו על התאים למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגנים מפני אור. בתום הדגירה, צנטריפוגה את הצלחת והשליכו את הסופרנטנט, והשעו את הכדורים לנפח סופי של 200 מיקרוליטר של מאגר FACS לבאר לניתוח זרימה ציטומטרי.