בדיקת אגר פחם רזזורין להערכת פעילות תרכובת הבדיקה כנגד מיקובקטריות

קח צלחת מרובת בארות המכילה מיקובקטריה. הוסף ריכוזי תרכובות בדיקה הולכים וגדלים לבארות.

דגירה. בהתאם לפעולת התרכובת על מיקובקטריה, היא יכולה לעכב צמיחה מיקובקטריאלית, להציג פעילות בקטריוסטטית, או לחסל מיקובקטריה, מה שמדגים פעילות חיידקית.

העבירו היטב את הכמות לבדיקת אגר פחם רזזורין, או CARA, מיקרו-פלטה המכילה אגר עם פחם פעיל כדי לספוג את תרכובת הבדיקה, ולמנוע השפעות העברה.

דגירה. הפעילות הבקטריוסטטית של התרכובת מעכבת שכפול מיקובקטריאלי, בעוד שפעילות חיידקים מפחיתה את הכדאיות המיקובקטריאלית.

הוסף חיץ, רזזורין וחומר פעילי שטח לא יוני כדי לפזר רזזורין בבארות.

במיקובקטריות הפעילות מטבולית, הדהידרוגנאזות מצמצמות את הרסזורין בצבע כחול ופלואורסצנטי חלש לרסורופינה ורודה

.

בעזרת קורא מיקרו-פלטות, מדוד את הקרינה של רסורופין בבארות.

בארות חסרות פלואורסצנטיות של רסורופין מצביעה על פעילות חיידקית של התרכובת.

עוצמת הקרינה המשתנה על פני בארות מצביעה על עומס החיידקים החיים, המשקף את העוצמה החיידקית או הבקטריוסטטית התלויה בריכוז של תרכובות הבדיקה.

חסנו צינורות צנטריפוגה עגולים או חרוטיים מפוליפרופילן המכילים 4 או 20 מיליליטר בהתאמה של Middlebrook 7H9-ADN, או 7H9-OADC עם M. smegmatis ב-OD₅₈₀ של 0.01 עד 0.1. דגרו על תרביות M. smegmatis ב-37 מעלות צלזיוס ו-20% O₂ עם טלטול, והרחיבו את התרביות לשלב אמצע העץ או OD משוער של₅₈₀ של 0.5.

כדי להגדיר ניסוי בסגנון ריכוז מעכב מינימלי בתנאי שכפול ולא שכפול, יש להפיץ 200 מיקרוליטר של תאים ב-7H9-ADN ב-OD₅₈₀ של 0.01 לכל הבארות של צלחת 96 בארות שטופלה בתרבית רקמה שקופה.

עבור הבדיקה שאינה משתכפלת, השתמש ב-PBS המכיל 0.02% טילוקספול כדי לשטוף את התאים פעמיים והשתמש במדיום שאינו משכפל כדי להשעות מחדש את התאים. השתמש במדיום שאינו משתכפל כדי לדלל את התאים ל-OD₅₈₀ של 0.1, והוסף נתרן ניטריט לריכוז סופי של 0.5 עד 5 מילי-מולרי ממלאי טרי של 1 מולאר.

מחלקים 200 מיקרוליטר של תאים ב-OD₅₈₀ של 0.1 לכל הבארות של צלחת 96 בארות שטופלה בתרבית רקמה שקופה. לאחר הכנת חומרי בדיקה לפי פרוטוקול הטקסט, הוסף 2 מיקרוליטר של חומר בדיקה #1 לשורות A עד E, ו-2 מיקרוליטר של חומר בדיקה #2 לשורות E עד H, וערבב היטב.

לצורך שכפול מבחנים, דגרו מיקרו-לוחות M. smegmatis ב-37 מעלות צלזיוס, 20% O₂ ו-5% CO₂ למשך 1 עד 48 שעות. בנקודות הזמן שבהן ה-CARA ישמש כקריאה, השתמש בפיפטה רב-ערוצית P200 המוגדרת ב-50 עד 75 מיקרוליטר כדי להשעות בזהירות את תכולת הבאר של לוחית הבדיקה בסגנון MIC90 על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 5 עד 10 פעמים. לאחר מכן, השתמש בקצות הפיפטה כדי לסובב בעדינות את תכולת הבארות בתנועה סיבובית.

העבירו 10 מיקרוליטר מתכולת באר הבדיקה הלא מדוללת לבארות המתאימות של המיקרו-פלטת CARA, הימנעו מהתזות במהלך ההעברות, והבטיחו כי ה-10 מיקרוליטר מזוהה באמצע בארות המיקרו-פלטות של CARA. בעזרת סרט צלחת, קשרו ערימות של מיקרו-צלחות CARA, ולאחר מכן, הניחו אותן בשקית ניילון הניתנת לסגירה חוזרת. דגרו את המיקרו-לוחות של M. smegmatis CARA ב-37 מעלות צלזיוס עם 20% O₂ למשך יום עד יומיים לשכפול צלחות ולמשך יומיים עד שלושה עבור צלחות שאינן משתכפלות.

כאשר סרט של גידול חיידקים, או מושבות מקרוסקופיות גדולות יותר נראים בבארות הבקרה השליליות, השתמש בסט יחיד של 12 קצות P200 עם פיפטה רב-ערוצית כדי להוציא 40 מיקרוליטר של PBS סטרילי לאורך צד הבארות, ולאפשר ל-PBS להתפזר על פני החלק העליון של מיקרו-מושבות חיידקי אגר.

הכן מגיב פיתוח CARA על ידי ערבוב של 5 מיליגרם רזזורין ו-50 מיליליטר של 5% טווין-80 ב-PBS. הוסף 50 מיקרוליטר של ריאגנט פיתוח CARA טרי לכל באר של המיקרו-צלחת של CARA. לאחר מכן, נדנד את הלוחות קדימה ואחורה כמה פעמים כדי לעזור להפיץ את המגיב על פני האגר ומחצלת החיידקים בכל באר. מניחים את הצלחות בשקית ניילון הניתנת לסגירה חוזרת, ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות עבור M. smegmatis.

לפני קריאת הקרינה יש להניח את המיקרו-פלטות של CARA במכסה מנוע למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כשהמכסים מוסרים. בעת שימוש בספקטרופוטומטרים BSL3 מחוץ לארון בטיחות ביולוגית, הדביקו מדבקת PCR באיכות אופטית מעל הצלחת, והשתמשו במגבת נייר רכה כדי לאטום היטב על ידי לחיצה עדינה על משטח המדבקה. קבע את הקרינה באמצעות קריאה עליונה עם עירור ב-530 ננומטר ופליטה ב-590 ננומטר.