בדיקה עבור NF-&kcy--תלוי TLR;B/AP-1 איתות גורם שעתוק במקרופאגים

קח צינורות המכילים מקרופאגים מדווחים עם הגן לפוספטאז אלקליין עוברי המופרש או אנזים SEAP תחת מקדם השראה.

בשפופרת אחת, הכניסו נוגדן ספציפי לקולטן דמוי מקרופאג Toll 2 או TLR2, ולנטרל את פעילותו.

באחר, הוסף מעכב לדיכוי איתות TLR4. השאירו את הצינור האחרון ללא טיפול.

קחו שקופית עם תא עם שכבה נספגת של דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק או DAMPs - חלבונים המשתחררים במהלך נמק תאים.

הוסף מקרופאגים מטופלים ולא מטופלים בבארות נפרדות ודגירה.

TLR2 ו-TLR4 על מקרופאגים לא מטופלים נקשרים ל-DAMPs, ומפעילים את גורמי השעתוק של הגורם הגרעיני-kappa-B, או NF-κB, וחלבון המפעיל-1, או AP-1.

אלה עוברים לגרעין ונקשרים למקדם SEAP, ומווסת את ייצור ה-SEAP, המופרש מחוץ לתא.

העבירו את הסופרנטנט המכיל SEAP למיקרו-פלטה עם מצע כרומוגני.

SEAP מבצע הידרוליזה של המצע, ומייצר מוצר בצבע סגול-כחול. מדוד את הספיגה.

נטרול TLR2 מפחית מאוד את ייצור SEAP, מה שמצביע על TLR2 כמתווך העיקרי.

כדי להעריך את ההשפעות של שכבת חלבון נספגת על פעילות NF-kB/AP-1 בתיווך קולטן דמוי טול, לאחר גידול מקרופאגים מדווחים בבקבוק בגודל מתאים למפגש של 70%, נתק את התאים עם תמיסת דיסוציאציה אנזימטית מתאימה כפי שהודגם.

השעו מחדש את התאים בריכוז של 7.3 x 10⁵ תאים למיליליטר במדיום הבדיקה וחלקו את התאים באופן שווה בין שלושה צינורות. טפל בצינור הראשון של התאים ב