JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 5:54 דק' • July 8th, 2025
קח צלחת מרובת בארות המכילה פיברובלסטים של עכברים במדיה נטולת סרום. הוסף דילולים סדרתיים של נוגדנים ספציפיים ל-TNFα.
הוסף TNFα - ציטוקין דלקתי.
דגירה. מחסור בסרום גורם ללחץ תאי, מה שהופך את התאים לרגישים לאפופטוזיס בתיווך TNFα.
TNFα נקשר לקולטנים שלו על התאים חסרי הסרום מפעיל מפלי איתות תוך תאיים, מפעיל את מפל הקספאז וגורם לאפופטוזיס.
עם זאת, קשירת נוגדנים ל-TNFα מונעת את קשירת הקולטן שלו, ומעכבת את הפעלת הקספאז.
לאחר הדגירה, הוסף תערובת ריאגנטים המכילה חומר ניקוי, מצע קספאז זוהר ואנזים לוציפראז יחד עם יוני ATP ומגנזיום. מערבבים ודוגרים.
חומר הניקוי מחלחל לממברנות, ומשחרר קספזות מתאים המושרים על ידי TNFα.
המצע הביולוגי מכיל אתר זיהוי קספאז. קספזות ספציפיות מבקעות את המצע ומייצרות אמינולוציפרין.
לוציפראז מחמצן את המצע שלו, אמינולוציפרין, וכתוצאה מכך פליטת אור.
למדוד את עוצמת הזוהר כדי לזהות ירידה בזוהר עם עלייה בריכוזי הנוגדנים, מה שמצביע על העוצמה של הנוגדנים הספציפיים של TNFα לנטרול TNFα ומניעת אפופטוזיס המושרה על ידי TNFα.
הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים ל-60 הבארות הפנימיות של לוחית הבדיקה, החל מהעמודה 2 ועד ה-11. מערבבים תרחיף תאים על ידי פיפטינג כדי להוסיף אליציטוטים למיקרופלייט. מיד, העבירו 50 מיקרוליטר מהדילולים הממופים ללוחית הבדיקה.
עבור נתיבים מקבילים, חלק דילולים על ידי סיבוב המיקרופיפטה. ניתן להזרים את הדילולים הממופים לבארות בסדר הבא. הבקרות מחולקות בבארות שמסביב.
לדלל TNF-alpha עם 500 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד. מערבבים על ידי מערבל מערבולת ב-2,200 סל"ד. מעבירים לצינור של 15 מ"ל, ולבסוף מדללים ל-40 ננוגרם למ"ל עם מדיום תרבית בדיקה. הוצא 50 מיקרוליטר מתמיסת אינדוקציה לאפופטוזיס לתוך 60 הבארות החיצוניות הפנימיות. הוצא מיקרוליטר של תמיסת אינדוקציה לאפופטוזיס לתוך 60 בארות הבדיקה הפנימיות. לבסוף, דגרו למשך 16 שעות.
ביום החמישי, יש להרכיב מחדש את המצע עם תמיסת החיץ שלו לפי הוראות היצרן. מערבבים על ידי היפוך חמש פעמים. הוציאו את תמיסת המצע, והוסיפו 50 מיקרוליטר מתמיסת המצע לכל דגימה היטב בצלחת הבדיקה. כמו כן, הוסף מצע לפקדים. מערבל את הבדיקה במיקסר מערבולת ב-400 סל"ד למשך שלוש דקות.
הוצא את צלחת הבדיקה מהמיקסר ודגר בטמפרטורת החדר. הפעל ספקטרופוטומטר של קורא לוחות. פתח את תוכנת Softmax Pro או כל תוכנית מקבילה. טען מיקרופלייט לתוך הספקטרופוטומטר והתאם את הפרמטרים הבאים.
הפעל את פונקציית הזוהר בסוג המתקן לפונקציית נקודת קצה. כוונן את שטח המתקן למעט עמודות 1 ו-12. בחר את סוג הצלחת למיקרופלטה תחתונה שקופה סטנדרטית של 96 בארות. שנה את זמן האינטגרציה עד 1250 אלפיות השנייה. התאם את זמן הטלטול של המיקרופלייט ל-10 שניות. בחר את הקיר בו יוצב חומר ייחוס, חומר אנליטי ודגימת בקרה. התחל לקרוא.