בדיקת תאים דנדריטיים בפולסים במבחנה המבוססת על חיסון כדי לגרום לשגשוג לימפוציטים

התחל בהוספת אנטיגנים של חיסון הבדיקה לתרבית התאים הדנדריטיים.

התא הדנדריטי מזהה את האנטיגן, מפנים אותו באמצעות אנדוציטוזיס בתיווך קולטנים, מפצל אותו לפפטידים קטנים יותר ומעביר את קומפלקס האנטיגן-MHC שנוצר אל פני התא לצורך הצגה.

תרבית משותפת של תאים דנדריטיים המציגים אנטיגן עם לימפוציטים T נאיביים כדי לאפשר אינטראקציה בין קולטן תאי T לקומפלקס האנטיגן-MHC, יחד עם הקולטנים המשותפים שלהם.

זה מוביל להיווצרות סינפסות אימונולוגיות, המפעילות לימפוציטים מסוג T באמצעות איתות תוך-תאי.

לימפוציטים T מופעלים עוברים התרחבות משובטת, ויוצרים לימפוציטים T אפקטיביים.

הוסף מולקולות ציטוקין אינטרלוקין-2, או IL-2, לתרבית ודגירה. הקישור של IL-2 מפעיל איתות תוך-תאי, המאפשר התפשטות והישרדות של לימפוציטים.

קח נפח קטן של התרבות והצנטריפוגה. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את כדור התא עם תאים דנדריטיים המציגים אנטיגן והעבירו אותו לאותה באר.

גירוי מחדש עם אנטיגן מגביר את התפשטות הלימפוציטים.

בצע ניתוח במורד הזרם כדי לכמת סמנים ספציפיים הקשורים להתפשטות לימפוציטים.

כדי לייצר MoDCs פועמים אנטיגן, הוסף 1 מיקרוליטר למיליליטר של חיסון נגד נגיף הכלבת או תרחיף קרוואנים ל-1 מיליליטר של תרבית MoDC נאיבית בצלחת של 24 בארות, ודגר את הצלחת למשך 48 שעות ב-5% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס. ביום השביעי, שמור את צלחת 24 הבארות המכילה את ה-MoDCs עם פעימות אנטיגן על קרח למשך 10 דקות לפני הוספת 1 מיליליטר של PBS קר כקרח לכל באר, וערבב אותה היטב. העבירו את המתלה לצינור של 15 מיליליטר.

שוטפים את הבארות עם 2 מיליליטר PBS קר כקרח. אוספים את התאים הנותרים בתוך כל באר, ומעבירים את התוכן השטוף לצינורות שלהם. צנטריפוגה את מתלה התאים ב -500 גרם למשך 7 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור התא של ה-MoDC בפולס אנטיגן במדיום תרבית שלם כדי להתאים את הריכוז הסופי של 100,000 תאים למיליליטר.

עבור תרבית משותפת של לימפוציטים של MoDC, זרעו את הבארות של צלחת סטרילית של 24 בארות עם 1 מיליליטר של תרחיף תאי הלימפוציטים הנאיבי ו-1 מיליליטר של תרחיף MoDC פועם אנטיגן או לא פועם אנטיגן ביום השביעי של דופק האנטיגן. לאחר יומיים של דגירה, יש להשלים כל באר עם 20 ננוגרם למיליליטר אינטרלוקין-2 רקומביננטי, ולהמשיך את הדגירה למשך 120 שעות נוספות.

ביום ה-14, העבירו 1 מיליליטר מהתרבית המשותפת לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה את הצינור. לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא עם 1 מיליליטר של MoDCs פועמים אנטיגן או לא פולסים. מערבבים היטב ומעבירים את מתלי התאים לבארות המתאימות להם.

לאחר צביעת פני התא של PBMCs ולימפוציטים ומונוציטים נאיביים, העבירו 1 מיליליטר מתרחיף התא לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה, וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-500 גרם. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה ב-1 מיליליטר PBS והעבירו אותה לצינור של 15 מיליליטר. כמו כן, אסוף את התאים הנותרים ואת הצינורות המתאימים באמצעות 1 מיליליטר PBS. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיליליטר PBS לצינור ה-15 מיליליטר המכיל את התאים, וערבבו על ידי פיפטינג.

לאחר צנטריפוגה של הצינור במשך 7 דקות במשקל של 850 גרם, הסר את הסופרנטנט והשהה בזהירות את כדור התא עם שאריות השעיה שנותרו לאחר סילוק הסופרנטנט. העבירו את מתלה התא לצלחת 96 בארות עם תחתית V, ואטמו את הבארות כדי למנוע שפיכה.

לאחר השלמת הצביעה, בצע את ניתוח ציטומטר הזרימה. מהתצוגה המקדימה בזמן אמת, התאם את סף הקרינה כולל מתח, ורווח וגודל התא כדי לצייר בסופו של דבר שערים סביב אוכלוסיית התאים הרצויה תוך אי הכללת כל פסולת סלולרית.