טכניקת צביעת טטרמר פפטיד-MHC-I לניתוח תאי זיכרון מסוג CD8⁺ ספציפיים ל-SIV

קח תאים חד-גרעיניים מדם היקפי של פרימטים שאינם אנושיים, או PBMCs, המכילים תאי זיכרון T CD8⁺ כנגד נגיף הכשל החיסוני הסימיאני או SIV.

הוסף מעכב חלבון קינאז כדי למנוע הפנמה של קולטן תאי T, או TCR עם גירוי לאחר מכן.

הציגו קומפלקס תאימות היסטולוגית פפטידית-מז'ורי מסוג I, או טטרמרים pMHC-I, קומפלקסים מצומדים פלואורופור הכוללים ארבע מולקולות MHC-I הקשורות לפפטידים ספציפיים ל-SIV. פפטידים אלה נקשרים ל-TCR על פני השטח של תאי T.

הוסף תערובת המכילה נוגדנים מצומדים פלואורופור הנקשרים ל-CD8, CD28 ו-CCR7 - סמנים התוחמים תת-קבוצות של תאי זיכרון T - ונוגדנים המסמנים תאים שאינם CD8⁺.

צבע כדאיות פלואורסצנטי מסמן תאים מתים.

תקן את התאים. לחדור אותם כדי לגשת למטרות תוך-תאיות.

הוסף נוגדנים מצומדים פלואורופור הקושרים CD3, סמן תאי T, וגנזים תוך-תאי B, סמן תאי CD8⁺ T מופעל.

באמצעות ציטומטריית זרימה, אל תכלול תאי T שאינם CD8⁺ ותאים מתים.

תאי CD8⁺ T חיוביים של טטרמר שער pMHC-I לאפיון תת-קבוצות שונות של תאי CD8⁺ T בזיכרון בהתבסס על רמות גרנזים B, CD28 ו-CCR7.

התחל בהשעיית ה-PBMCs של רזוס במדיום R-10 בריכוז של 1.6 כפול 10 עד שביעי תאים למיליליטר. יש להקצות 50 מיקרוליטר של תאים למספר המתאים של צינורות ציטומטריית זרימה, ולהוסיף 50 מיקרוליטר של מעכב חלבון קינאז לכל צינור. מערבל כל צינור, ודוגר על הדגימות בטמפרטו