כימות פעילות קיבוע אוטופגית בתפזורת בתאי יונקים

אוטופגיה בתפזורת כוללת קיבוע מטען אוטופאגי וחלבונים ציטוזוליים מסיסים, כולל לקטט דהידרוגנאז או LDH, בתוך אוטופאגוזומים לצורך פירוק.

כדי להעריך את קיבוע ה-LDH, המשקף פעילות אוטופאגית בתפזורת, קח קובטה אלקטרופורציה עם תאים רעבים לחומרים מזינים שטופלו במעכבים כדי לחסום פירוק אוטופגי-ליזוזומלי.

בצע אלקטרופורציה כדי לשבש באופן סלקטיבי את קרום התא ולשחרר חלבונים מסיסים.

מערבבים את שיבוש התאים עם תמיסת סוכרוז חוצצת כדי לשמר את הרכיבים התאיים.

העבר את תמיסת השיבוש המדוללת הנדרשת לצינור המכיל חוצץ. צנטריפוגה להפרדת LDH לא מבודד מ-LDH מבודד אוטופאגוזום.

העבר את תמיסת השיבוש המדוללת שנותרה, המכילה את חלק ה-LDH התאי הכולל, לצינור אחר.

הוסף מאגר המכיל פעילי שטח לא יוניים לשני הצינורות כדי לחלץ שברי LDH מבודדים וכוללים.

צנטריפוגה והעברת סופרנטנטים המכילים LDH לצינורות המכילים חוצץ עם פירובט ו-NADH.

LDH ממיר פירובט ללקטט עם חמצון NADH, ומפחית את רמות ה-NADH בקורלציה עם ריכוז ה-LDH.

כמת LDH בשברים תאיים משוקעים וכוללים כדי לקבוע את קיבוע ה-LDH.

בעזרת פיפטה, השעו מחדש את כדור התא כדי לקבל תרחיף כמעט תא בודד. העבר את המתלה הזה לקובטה אלקטרופורציה של 4 מילימטר. הנח את הקובט באלקטרופורטור גל דעיכה אקספוננציאלי ושחרר פולס חשמלי יחיד ב-800 וולט, 25 מיקרופאראד ו-400 אוהם.

השתמש בקצה פיפטה חדש כדי להעביר את התא המשבש אותו לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה בגודל 1.5 מילימטר המכיל 400 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז עם חוצץ פוספט קר כקרח, וערבב קצרות על ידי פיפטינג. חזור על תהליך ההשעיה מחדש, שיבוש האלקטרודות והערבוב עבור כל דגימה. אם מבצעים את ההליך בפעם הראשונה, הקפידו לוודא שיבוש יעיל וסלקטיבי של אלקטרודות קרום הפלזמה כמתואר בטקסט.

כדי להשיג שברי LDH משוקעים, הסר 550 מיקרוליטר מכל תמיסה משובשת בתא מדולל, והעבר אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה משלו בנפח 2 מיליליטר המכיל 900 מיקרוליטר של מאגר השעיה קר כקרח עם 0.5% BSA ו-0.01% Tween-20. פיפטה קצרה לערבב. צנטריפוגה ב-18,000 פעמים גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות לייצור כדורים המכילים LDH משקע. בעזרת יניקה, שאפו היטב את הסופרנטנט כדי להשאיר את הכדורים יבשים ככל האפשר.

אחסן את דגימות ה-LDH המשקעות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לניתוח. עבור סך כל חלקי ה-LDH, העבירו 150 מיקרוליטר מכל אחד מהתמיסות המדוללות שהופרעו על ידי התאים לצינור החדש שלו. אחסן אותם במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לניתוח.

להפשיר גם את ה-LDH המשקע וגם את סך דגימות ה-LDH על הקרח. לאחר ההפשרה, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר מתלה קר כקרח המכיל 1.5% טריטון X-405 לסך דגימות ה-LDH. סובב את הדגימות על רולר בחדר קר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 750 מיקרוליטר של מאגר השעיה קר כקרח המכיל 1% טריטון X-405 לדגימות ה-LDH המשקעות. השתמש בפיפטה כדי להשעות מחדש את הכדורים עד שהתמיסה תהיה הומוגנית. צנטריפוגה של כל הדגימות בטמפרטורה של 18,000 פעמים גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לשקוע פסולת תאית לא מומסת.

לאחר השלמת הצנטריפוגה, הניחו את הדגימות על קרח. קבע את רמות ה-LDH בסופרנטנטים באמצעות מבחן אנזימטי קלאסי כמתואר בטקסט או כל אחת מהמגוון הרחב של ערכות זמינות מסחרית.