כימות פעילות קיבוע אוטופגית בתפזורת בתאי יונקים

אוטופגיה בתפזורת כוללת קיבוע מטען אוטופאגי וחלבונים ציטוזוליים מסיסים, כולל לקטט דהידרוגנאז או LDH, בתוך אוטופאגוזומים לצורך פירוק.

כדי להעריך את קיבוע ה-LDH, המשקף פעילות אוטופאגית בתפזורת, קח קובטה אלקטרופורציה עם תאים רעבים לחומרים מזינים שטופלו במעכבים כדי לחסום פירוק אוטופגי-ליזוזומלי.

בצע אלקטרופורציה כדי לשבש באופן סלקטיבי את קרום התא ולשחרר חלבונים מסיסים.

מערבבים את שיבוש התאים עם תמיסת סוכרוז חוצצת כדי לשמר את הרכיבים התאיים.

העבר את תמיסת השיבוש המדוללת הנדרשת לצינור המכיל חוצץ. צנטריפוגה להפרדת LDH לא מבודד מ-LDH מבודד אוטופאגוזום.

העבר את תמיסת השיבוש המדוללת שנותרה, המכילה את חלק ה-LDH התאי הכולל, לצינור אחר.

הוסף מאגר המכיל פעילי שטח לא יוניים לשני הצינורות כדי לחלץ שברי LDH מבודדים וכוללים.

צנטריפוגה והעברת סופרנטנטים המכילים LDH לצינורות המכילים חוצץ עם פירובט ו-NADH.

LDH ממיר פירובט ללקטט עם חמצון NADH, ומפחית את רמות ה-NADH בקורלציה עם ריכוז ה-LDH.

כמת LDH בשברים תאיים משוקעים וכוללים כדי לקבוע את קיבוע ה-LDH.

בעזרת פיפטה, השעו מחדש את כדור התא כדי לקבל תרחיף כמעט תא בודד. העבר את המתלה הזה לקובטה אלקטרופורציה של 4 מילימטר. הנח את הקובט באלקטרופורטור גל דעיכה אקספוננציאלי ושחרר פולס חשמלי יחיד ב-800 וולט, 25 מיקרופאראד ו-400 אוהם.

השתמש בקצה פיפטה חדש כדי להעביר