בדיקה לסינון ננו-חלקיקים ביו-אקטיביים לעיכוב איתות קולטן דמוי אגרה

קח צלחת מרובת בארות עם מקרופאגים מדווחים שונים המכילים את הפוספטאז האלקליין העוברי המופרש, או SEAP, גן או גן לוציפראז המופרש תחת מקדמים הניתנים להשראה.

הוסף מדיה המכילה הכלאות שונות של ננו-חלקיקי פפטיד-זהב מעורבבים עם ליפופוליסכרידים או LPS לבארות ייעודיות.

LPS נקשר לקולטנים דמויי אגרה של מקרופאגים, או TLR, ומפעיל הפנמה לאנדוזום.

משאבת הפרוטונים האנדוזומלית מעבירה פרוטונים פנימה. ההחמצה מפעילה איתות TLR, ומפעילה גורמי שעתוק.

גורמים אלה גורמים לביטוי הגנים המדווחים, ומייצרים SEAP או לוציפראז.

לחלופין, הפנמה של LPS יחד עם ההיברידיות גורמת לקבוצות הפפטידים הטעונות שלילית ללכוד פרוטונים לומינליים, למנוע החמצה אנדוזומלית ולעכב איתות TLR.

אסוף את המדיה, הצנטריפוגה כדי להפריד את הסופרנטנט, והוסף מצעים ל-SEAP ולוציפראז.

SEAP ממיר את המצע שלו למוצר צבעוני, בעוד שלוציפראז מזרז את המצע שלו כדי לייצר זוהר.

הפחתה באותות המדווחים מצביעה על יעילות ההיברידיות בעיכוב איתות TLR.

צנטריפוגה 20 נפחים של התמיסה ההיברידית פפטיד-GNP בצינורות אפנדורף של 1.5 מיליליטר ב-18,000 פעמים גרם למשך 30 דקות. השליכו בזהירות את הסופרנטנטים. העבירו את ההיברידיות לצינור טרי אחד, ושטפו אותם פעמיים עם 1 מיליליטר PBS. לאחר מכן, השעו מחדש את הכלאיים השטופים בנפח אחד של מדיום R10. מערבבים נפחים שווים של הכלאיים המרוכזים והמדיום R10 המכיל LPS כך שהריכוז הסופי של ההיברידיות וה-LPS הוא 100 מאה ננו-מולרי ו-10 ננוגרם למיליליטר בהתאמה.

לאחר מכן, הסר את מדיום התרבות מצלחת תרבית המקרופאגים. הוסף 100 מיקרוליטר מתערובת ה-LPS ההיברידית לכל באר עם שלושה שכפולים לכל מצב. כלול בקרה שלילית ובקרת LPS. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, ואז העבירו את המדיום של כל באר לצינור צנטריפוגה נפרד. צנטריפוגה של הצינורות ב-18,000 פעמים גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מעבירים את הסופרנטנטים לצלחת תחתונה עגולה טרייה של 96 בארות.

כדי להתחיל בבדיקת הכתב על דגימות אלה, הוסף 180 מיקרוליטר של תמיסת QUANTI-Blue מחוממת מראש לכל באר של צלחת תחתונה שטוחה חדשה של 96 בארות, ולאחר מכן העביר 20 מיקרוליטר של הסופרנטנטים מכל דגימה לצלחת זו. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים עד שהצבע הכחול הכהה מתפתח לצפיפות אופטית מעל 1. לאחר מכן, השתמש בקורא צלחות כדי להקליט את הספיגה ב-655 ננומטר. לאחר מכן, העבירו 10 מיקרוליטר של סופרנטנט טרי מכל דגימה לצלחת לבנה שקופה עם תחתית שטוחה של 96 בארות.

בעזרת מזרק אוטומטי, הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת הלוציפראז לכל באר ורשום מיד את הזוהר היטב. לאחר מכן, אמת את ההשפעה המעכבת של המועמדים הפוטנציאליים והעריך את ספציפיות ה-TLR כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.