בדיקת מיקוד לכימות טיטרים של וירוסים באיברים של עכבר נגוע

קח צלחת מרובת בארות המכילה שכבה אחת של תאי יונקים.

לחסן את הבארות בדילולים סדרתיים של רקמות הומוגניות המכילות את נגיף הזיקה, שמקורן באיברים שונים של עכבר נגוע.

עם הכניסה לתאים באמצעות אנדוציטוזיס, הנגיף מתרבה ומדביק תאים שכנים.

שכבה עם תמיסת מתיל צלולוז בעלת צמיגות גבוהה, היוצרת מחסום פיזי המגביל את תנועת הנגיף.

המחסום מאפשר רק הדבקה של תאים שכנים מיידיים, ויוצר מוקדים של תאים נגועים, ומבטיח שכל מוקד מקורו בחלקיק נגיף בודד, מה שמאפשר כימות מדויק.

תקן את התאים וחלחל את הממברנה. הוסף נוגדנים ראשוניים שנכנסים לתאים ומקיימים אינטראקציה עם האנטיגן הנגיפי.

הציגו נוגדן משני מצומד פרוקסידאז שנקשר לנוגדנים הראשוניים.

הוסף מצע כרומוגני המומר על ידי פרוקסידאז ליצירת כתמים צבעוניים, המציין את המוקדים של תאים נגועים.

ספרו את המוקדים כדי לכמת את טיטר הנגיף באיברים השונים של העכבר.

מוציאים את הדגימות ההומוגניות מהמקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס ומניחים להן להפשיר. כשהדגימות מונחות על קרח, יש לדלל את נגיף הזיקה פי 10 לבאר הראשונה של צלחת הדילול, ולהשתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לבצע דילול סדרתי פי 10 במורד הצלחת, תוך שינוי קצוות בכל פעם על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של דגימה ל-180 מיקרוליטר של מצע גידול.

החלף את קצות הפיפטה בין כל דילול. הכן את הצלחת היוצרת מיקוד על ידי הסרת המדיה מהצלחת המוכנה עם תחתית שטוחה של 96 בארות המכסה תאי Vero. כדי למנוע את התייבשות השכבה החד-שכבתית, הוסף מיד 100 מיקרוליטר של דילול הנגיף לכל באר בצלחת Vero. השתמש באותו סט טיפים כדי להוסיף מהריכוז הנמוך ביותר לגבוה ביותר.

לוחות סלע מצד לצד 2 עד 4 פעמים, ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה עד שעתיים. יש לחמם 2% מתיל צלולוז לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לדלל את תמיסת המתיל צלולוז של 2% במצע הגידול ביחס של כ-2 ל-1. לאחר הדגירה, הוסף 125 מיקרוליטר ממצע הגידול של מתיל צלולוז לכל באר של צלחות 96 הבארות. דגרו שוב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 32 עד 40 שעות.

כדי לתקן את תאי ה-Vero, בארון בטיחות ביולוגית, הוסף 50 מיקרוליטר של 5% פרפורמלדהיד מעל החלק העליון של שכבת המתיל צלולוז בכל באר של לוחות 96 הבארות. דגירה למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לחלופין, מכסים את הצלחות בפרפילם, ומניחים אותן על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי להסיר כיסוי ומדיה מהתאים למיכל חד פעמי בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. יש לשטוף בעדינות עם 150 מיקרוליטר PBS לבאר. הסר PBS מהצלחות והסר את הצלחת מארון הבטיחות הביולוגית. חזור על שטיפת ה-PBS פעמיים. לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר לבאר פעם אחת מאגר שטיפת FFA והשאיר בטמפרטורת החדר למשך 5 עד 10 דקות כדי לחלחל לתאים הקבועים.

לאחר מכן, השתמש בנוגדנים ראשוניים של זיקה כדי לזהות זיהום. הכן את הנוגדן העיקרי 4G2 בריכוז של 1 מיקרוגרם למיליליטר במאגר צביעה FFA. העיף את מאגר הכביסה FFA מהצלחות, והוסף 50 מיקרוליטר של הנוגדן העיקרי במאגר צביעת FFA לכל באר. לאחר מכן, אטמו את הצלחות בעזרת פרפילם או סרט פלסטיק, ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

הכן את הנוגדן המשני נגד עכברים עם תווית HRP של עז בריכוז של 1 עד 5,000 במאגר צביעה FFA. לאחר הסרת תמיסת הנוגדנים, יש לשטוף תאים שלוש פעמים עם מאגר כביסה FFA של 150 מיקרוליטר לבאר. הסר את מאגר הכביסה על ידי החלקה לכיור בכל פעם.

צבעו את התאים עם הנוגדן המשני במאגר צביעה FFA ב-50 מיקרוליטר לבאר, ודגרו שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו תאים שלוש פעמים עם מאגר כביסה FFA שוב, והסירו את מאגר הכביסה על ידי החלקה לכיור בכל פעם.

הוסף 50 מיקרוליטר ממצע Trueblue לכל באר. המתן 2 עד 15 דקות עד שהכתמים מוגדרים במלואם עם רקע מינימלי. לאחר שהכתמים נראים לעין, יש לשטוף בעדינות במים בעזרת יד כדי להגן על השכבה המונו-שכבתית מעוצמת המים הזורמים. יבש ברז על מגבות נייר.

זמן קצר לאחר מכן, השתמש בטווח ניתוח כדי לספור ידנית את הכתמים בכל באר או השתמש במונה נקודתי אוטומטי. בתוכנת הלכידה החיסונית, בחר דילול עם מוקדים המובחנים בקלות בין 20 ל-200 לבאר עבור כל דגימה, וחשב טיטר ביחידות יוצרות מיקוד למיליליטר באמצעות הממוצע של בארות כפולות.