בדיקה חוץ גופית לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפיל במקרופאגים

קח שני מיקרו-לוחות המכילים כיסויים עם מקרופאגים שמקורם במח עצם או BMM.

הוסף פרומסטיגוטים מטאציקליים של לישמניה, השלב המוארך עם הלקאה - לצלחת אחת, ואמסטיגוטים - השלב הסגלגל ללא הלקאה - בצלחת אחרת.

במהלך הדגירה, הטפילים נקשרים לקולטני מקרופאגים, ומפעילים פגוציטוזיס בתיווך קולטנים.

הפגוזום מתמזג עם הליזוזומים והשלפוחיות שמקורם ברטיקולום האנדופלזמי ומנגנון גולגי, ומבשיל לוואקואול טפילי.

ה-pH הנמוך של הוואקואול מפעיל התמיינות פרומסטיגוט לאמסטיגוט ושכפולו.

שטפו כדי להסיר טפילים לא מופנמים.

תקן את המקרופאגים הנגועים והוסף חומר ניקוי כדי לחלחל לתאים ולטפילים.

הכניסו צבע חומצת גרעין פלואורסצנטית כדי לצבוע את המקרופאגים וגרעיני הטפילים.

הרכיבו את הכיסויים על שקופיות והתבוננו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מכמתים את גרעיני המארח הגדולים יותר ואת גרעיני האמסטיגוטים הקטנים יותר.

השווה את מספרי האמסטיגוטים כדי להעריך את ההתרבות שלהם בתוך מקרופאגים שנדבקו בתחילה בפרומסטיגוטים לא מובחנים לעומת אלה שנדבקו באמסטיגוטים משוכפלים.

כדי להדביק את התאים ב-L. Amazonensis, יש לדלל את תרחיף הטפיל לריבוי הניסוי המתאים של זיהום, ולהוסיף 50 עד 100 מיקרוליטר של טפילים לכל באר של כל צלחות 6 הבארות, כולל כל נקודות הזמן של הניסוי. דגרו את המקרופאגים שמקורם במח העצם לתקופת ההדבקה והטמפרטורה המתאימים. לאחר מכן, שטפו את הבארות שלוש פעמים עם 2 מיליליטר PBS טרי של 37 מעלות צלזיוס ללא סידן או מגנזיום לבאר, וקבעו את דגימות נקודת הזמן הראשוניות עם 1.5 עד 2 מיליליטר של 2% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות.

עבור הצלחות המתאימות לנקודות הזמן המאוחרות יותר, הוסף 2 מיליליטר של מדיום מקרופאג טרי שמקורו במח עצם לכל באר והחזיר את הצלחות לחממה המתאימה. לאחר מכן, תקן ושטוף את התאים עבור כל נקודת זמן שנותרה כפי שהודגם זה עתה, ואחסן את הדגימות ב-4 מעלות צלזיוס ב-PBS טרי.

כדי להכתים את התאים ב-DAPI, החלף את הסופרנטנט ב-1.5 מיליליטר PBS טרי ללא סידן ומגנזיום, בתוספת חומר ניקוי לא יוני של 0.1% למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש שטיפות של 2 מיליליטר עם PBS ללא סידן או מגנזיום. לאחר מכן, צבעו את התאים ב -2 מיקרוגרם למיליליטר DAPI ב -1 מיליליטר PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר שלוש כביסות, הנח את הכיסויים עם צד התא כלפי מטה על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית בודדות המותקנות עם מגיב הרכבה נגד דהייה זמין מסחרית. לאחר מכן, כדי לכמת את מספר התאים הנגועים, השתמש במטרת שמן הטבילה פי 100 של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומונה עמנואל, כדי לזהות את מספר גרעיני האמסטיגוטים הקטנים יותר המקובצים סביב כל גרעין מקרופאג גדול מוכתם DAPI.