בדיקת שחרור צבע לכימות הפעילות האנזימטית של חלבונים אנטי-מיקרוביאליים

התחל בצינור המכיל תרחיף חיידקים שנהרג בחום וטפל בתמיסת צבע.

מולקולות הצבע נקשרות קוולנטית לפפטידוגליקן - מרכיב חיוני בדופן התא החיידקי, ומעניקות צבע כחול.

גלולה את החיידקים והסר את הסופרנטנט המכיל מולקולות צבע לא קשורות.

השעו מחדש את החיידקים והכניסו תמיסת חלבון אנטי-מיקרוביאלית לצינור, מה שמפעיל הידרוליזה אנזימטית של הפפטידוגליקן החיידקי, וכתוצאה מכך פירוק דופן התא ואחריו ליזיס תאים.

זה מוביל לשחרור מולקולות הצבע, מה שמעניק צבע כחול.

הוסף אתנול - חומר דנטור חלבון, מנטרל את החלבונים האנטי-מיקרוביאליים ומפסיק את התגובה האנזימטית.

צנטריפוגה את התוכן כדי לגלול את שברי התאים והאנזימים. העבירו את הסופרנטנט המכיל מולקולת צבע לצלחת מרובת בארות.

בעזרת קורא צלחות, מדוד את הספיגה ב-595 ננומטר.

השווה את הספיגה של הדגימה שטופלה באנזים לזו של הדגימה שלא טופלה באנזים כדי לכמת את הפעילות האנזימטית של החלבון האנטי-מיקרוביאלי.

בבדיקת שחרור הצבע, המצע מקושר קוולנטית לצבע Remazol Brilliant Blue R או RBB. התחל פרוטוקול זה על ידי יצירת תמיסת RBB של 200 מילי-מולרי. ממיסים 1.25 גרם RBB בתמיסת נתרן הידרוקסיד טרייה.

לאחר מכן, השעו מחדש תאי חיידקים שנהרגו בחום בריכוז של 0.5 גרם משקל רטוב ב-30 מיליליטר של תמיסת RBB. עבור פפטידוגליקן מטוהר, השעו מחדש את הפפטידוגליקן בריכוז של 0.3 גרם משקל רטוב ו -30 מיליליטר תמיסת RBB.

מכיוון שהשלבים הבאים זהים ללא קשר למצע בו נעשה שימוש, התיוג יודגם רק עבור תאי החיידקים. דגרו את תערובת התגובה על פלטפורמה מסתובבת למשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין. לאחר שש שעות מעבירים את תערובת התגובה לאינקובטור של 4 מעלות צלזיוס, ודוגרים למשך 12 שעות נוספות בערבוב עדין.

בסיום הדגירה, קצרו את המצע הצבוע על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 3,000 פעמים גרם למשך 30 דקות. שפכו את תמיסת הצבע מגלולת המצע. השעו את הגלולה היטב במים מסוג 1 ואחריהם צנטריפוגה. שטפו את התאים המסומנים בצבע שלוש עד חמש פעמים באופן זה כדי להסיר צבע מסיס שאינו מקושר קוולנטית מהמצעים.

לכביסות סופיות, העבירו את חלק הגלולה שישמש בבדיקת שחרור הצבע לצינורות מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר. הסופרנטנט של הכביסה האחרונה צריך להיות ברור, ואילו המצע נשאר כחול. אחסן את המצע הצבוע תלוי בכמות מינימלית של מים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש.

כדי להתכונן לבדיקת שחרור הצבע, אפשר למצע הצבוע הקפוא לחזור לטמפרטורת החדר, ולשטוף פעמיים עם מאגר הבדיקה שנקבע אמפירית עבור האנזים. נעשה שימוש ב-PBS, במקרה זה. חשב את נפח תרחיף המצע הדרוש על ידי הכפלת נפח התגובה של 200 מיקרוליטר במספר בדיקות שחרור הצבע שיש לבצע.

להכנת מתלה המצע, הוסף תחילה את המצע הצבוע לנפח המתאים של PBS. בצע דילול אחד לאחד ובצע מדידה ראשונית של הצפיפות האופטית ב-595 ננומטר באמצעות PBS כריק. הוסף כמויות מצטברות של המצע הצבוע למתלה עד להשגת צפיפות אופטית של 2.0 ב-595 ננומטר.

בהדגמה זו, בדיקת שחרור הצבע תשמש לקביעת תנאי הדגירה האופטימליים עבור חלבון אנטי-מיקרוביאלי. ראשית, הכינו תרחיף אנטי-מיקרוביאלי של חלבון מלאי על ידי התאמת הריכוז ל-1 מיליגרם למיליליטר באמצעות PBS, כמתואר בטקסט הפרוטוקול. לאחר מכן, יש לדלל את התרחיף האנטי-מיקרוביאלי של חלבון המלאי לריכוז של 100 ננוגרם למיקרוליטר.

ריכוז זה נותן מסת תגובה סופית של 1 מיקרוגרם חלבון לנפח שנוסף לתגובת הבדיקה. בצע את מבחני התגובה בצינורות מיקרופוגה של 0.5 מיליליטר להערכת הטווח התרמי. עבור כל מצב תרמי, הוסף 10 מיקרוליטר מחלבון המלאי ל -200 מיקרוליטר של תרחיף מצע מוכן.

דגירה במחזור תרמי למשך שמונה שעות עם ערבוב על ידי היפוך פעם בשעה. לאחר הדגירה, עצרו את התגובות על ידי הוספת 25 מיקרוליטר אתנול לכל צינור מיקרופוגה. להסרת מצע בלתי מסיס לא מעוכל, צנטריפוגה ב -3,000 פעמים גרם למשך שתי דקות. לאחר מכן, תוך הקפדה לא לשבש את הגלולה של המצע הלא מעוכל, העבירו 150 מיקרוליטר של חומר התגובה עבור כל תערובת תגובה למיקרו-פלטה עם תחתית שטוחה של 96 בארות.

כדי לכמת את הפעילות האנזימטית, השתמש בספקטרופוטומטר מיקרו-פלטות כדי למדוד את הספיגה של הסופרנטנט ב-595 ננומטר. ספיגה מוגברת על ידי הצבע המסיס המשתחרר לתוך הסופרנטנט מהמצע המסומן היא מדידה כמותית של פעילות אנזימטית.