בדיקת שחרור צבע לכימות הפעילות האנזימטית של חלבונים אנטי-מיקרוביאליים

התחל בצינור המכיל תרחיף חיידקים שנהרג בחום וטפל בתמיסת צבע.

מולקולות הצבע נקשרות קוולנטית לפפטידוגליקן - מרכיב חיוני בדופן התא החיידקי, ומעניקות צבע כחול.

גלולה את החיידקים והסר את הסופרנטנט המכיל מולקולות צבע לא קשורות.

השעו מחדש את החיידקים והכניסו תמיסת חלבון אנטי-מיקרוביאלית לצינור, מה שמפעיל הידרוליזה אנזימטית של הפפטידוגליקן החיידקי, וכתוצאה מכך פירוק דופן התא ואחריו ליזיס תאים.

זה מוביל לשחרור מולקולות הצבע, מה שמעניק צבע כחול.

הוסף אתנול - חומר דנטור חלבון, מנטרל את החלבונים האנטי-מיקרוביאליים ומפסיק את התגובה האנזימטית.

צנטריפוגה את התוכן כדי לגלול את שברי התאים והאנזימים. העבירו את הסופרנטנט המכיל מולקולת צבע לצלחת מרובת בארות.

בעזרת קורא צלחות, מדוד את הספיגה ב-595 ננומטר.

השווה את הספיגה של הדגימה שטופלה באנזים לזו של הדגימה שלא טופלה באנזים כדי לכמת את הפעילות האנזימטית של החלבון האנטי-מיקרוביאלי.

בבדיקת שחרור הצבע, המצע מקושר קוולנטית לצבע Remazol Brilliant Blue R או RBB. התחל פרוטוקול זה על ידי יצירת תמיסת RBB של 200 מילי-מולרי. ממיסים 1.25 גרם RBB בתמיסת נתרן הידרוקסיד טרייה.

לאחר מכן, השעו מחדש תאי חיידקים שנהרגו בחום בריכוז של 0.5 גרם משקל רטוב ב-30 מיליליטר של תמיסת RBB. עבור פפטידוגליקן מטוהר, השעו מחדש את הפפטידוגליקן בריכוז של 0.3 גרם משקל רטוב ו -30 מיליליטר